التاثيرات الفيزياوية على الاحماض النووية الفايروسية

1. دنترة الحامض النووي

الدنترة Denaturation هي فك ازدواجية الحامض المزدوج الخيط سواء أكان الرنا المزدوج أو الدنا المزدوج حيث يكون الحامض المزدوج ثابتا عند الأس الهيدروجيني 7 وفي درجات الحرارة الاعتيادية، إلا انه يتعرض إلى التفكك وانفصال الخيطين عن بعضهما بسبب كسر الأواصر الهيدروجينية والأواصر الكاره للماء وذلك عند تعرضه إلى حرارة عالية تتراوح بين 70-80م أو في ظروف القاعدية أو الحامضية العالية، كما تحصل الدنترة أيضا بتأثير تراكيز عالية من الكحول الايثانولي أو اليوريا أو مواد أخرى. لا تؤثر الدنترة على الأواصر التساهمية الإسترية التي تربط النيوكليوتايدات. تتم عملية الدنترة بمرحلتين هما (1) انفصال الخيطين جزئيا مع بقاء اتصالهما بجزء صغير مزدوج وعند زوال المؤثر يعود الخيطين إلى ازدواجيتهما وتكاملهما، ومثال ذلك الدنترة بالحرارة حيث يعود الحامض إلى طبيعته المزدوجة بتبريده بشكل تدريجي وتسمى هذه العملية " إعادة الإزدواج Reannealing فتنخفض امتصاصيته للأشعة فوق البنفسجية (2) انفصال الخيطين عن بعضهما بشكل كامل وذلك باستمرار تأثير المؤثر وهي المرحلة الخطرة غير الرجعية التي لا يعود فيها الفايروس إلى ازدواجيته حتى بعد زوال المؤثر. يطلق على تأثير الحرارة المتلف للحامض النووي مصطلح "درجة ذوبان الحامض النووي" Melting point ورمزها Tm أو تسمى "الدرجة الوسطى" Midpoint temperature وتعرف بأنها " درجة الحرارة الواقعة عند النقطة الوسطية لمنحنى الذوبان، أي الدرجة التي ينفصل عندها الخيط المزدوج انفصالا يشمل نصف طول الحامض النووي"، (الشكل 1).

عندما تسخن الأحماض النووية المزدوجة فوق درجة انصهارها ينفصل الخيطان ويفقدان ازدواجهما ويفقد الحامض النووي حلزنته ويتحول من الشكل المحلزن إلى الوضع الالتفافي helix-to-Coil transition وبذلك تزداد قيمة امتصاصه للأشعة فوق البنفسجية بنسبة 50% وإن القاعدتين اللتين تلعبان الدور الأهم في تحديد قيمة درجة الانصهار هما الكوانين والسايتوسين فكلما ازدادت نسبة وجودهما في الحامض المزدوج كلما ارتفعت قيمة درجة انصهاره أي زاد تحمله للحرارة، وتتراوح درجة انصهار الدنا المزدوج بين 85-95م أما قيمتها للرنا المزدوج فتتراوح بين 90-100م، ويستفاد من درجة الانصهار لتقدير تركيبة القواعد النتروجينية في الأحماض النووية الفايروسية. قد يحصل للرنا المفرد حالة من الازدواج البسيط في نهايته بحدوث التفاف جزئي من احدي نهايتيه دون انفصاله مما يسبب نقصا في امتصاصه للأشعة فوق البنفسجية مقارنة بالخيط المفتوح.

أستفيد من ظاهرة إعادة ازدواج الخيطين Reannealing بعد حدوث الانصهار وانفصالهما وذلك بواسطة التبريد البطيء لمزيجهما في ابتكار تقانتي التهجين Hybridization والتفاعل المتسلسل للبوليميريز" PCR ، وهما التقانتين المستعملتين حاليا لمعرفة العلاقة الوراثية بين أنواع الفايروسات وتصنيفها اعتمادا على معرفة ومقارنة التعاقب النيوكليوتايدي.

تسبب ظروف القاعدية والحامضية عند مستوياتهما المتطرفة انصهارا للحامض النووي وبطريقة مماثلة لتأثير الحرارة وذلك لأنه عبارة عن مركب متعدد الكتروليتي Polyelectrolyte Compound ذو شحنة سالبة تحملها كل نيوكليوتايدة بسبب تأين الفوسفات ثنائية الأصرة الإسترية، ويحتفظ الحامض النووي بشحنته السالبة عند مدى أس هيدروجيني يتراوح بين 4-11 إلا انه خارج هذا المدى يتم منح بروتون إلى مجاميع الأمين الموجودة في قواعد الكوانين والسايتوسين والأدنين مما يسبب تحطم الأواصر الهيدروجينية الرابطة للقواعد المتقابلة في الخيطين وبذلك ينفصلان ويتفكك الحامض النووي. تتباين درجة الانصهار باختلاف نوع الحامض النووي اعتمادا على عدد قواعد السايتوسين والكوانين بسبب وجود ثلاث اواصر هيدروجينية بينهما.

الشكل (1): منحني درجه الذوبان (Tm) للحامض النووي المزدوج لفايروسي موزائيك القرنابيط (CaMV) بقيمة 75م وتقزم الرز (RDV) بقيمة 85م مع ملاحظة تصاعد قيم الامتصاصية (المحور الصادي) بزيادة درجات الحرارة وزيادة انفكاك خيطي الفايروسين.

الشكل مقتبس من  Hull 2002))  

2. زيادة الامتصاص الضوئي

زيادة الامتصاص الضوئي Hypochromic effect والتي يطلق عليها أيضا مصطلح Hyperchromy هي ظاهرة زيادة معدل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV) من قبل الحامض النووي المزدوج بسبب الدنترة حيث يمتص الخيط المفرد هذه الأشعة بمعدلات أعلى من امتصاص الخيطين المزدوجين، وتمتص النيوكليوتايدات هذه الأشعة بأعلى مستوى عند الطول الموجي 260 نانومتر، وهكذا فعند بدء انفكاك الخيطين عن بعضهما بعملية الدنترة تحدث زيادة ملحوظة في معدل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية بسبب تكشف النيوكليوتايدات، ولكن عند إعادة ازدواج الخيطين ينخفض امتصاص الأشعة وتسمى هذه الظاهرة "انخفاض الامتصاصية الضوئية" Hypochromic effect او Hypochromy والتي يتصف بها التركيب الحلزوني للحامض النووي المزدوج بسبب اصطفاف القواعد النتروجينية فوق بعضها ووجود الأواصر بين القواعد. إن ظاهرة الامتصاص الضوئي مفيدة في معرفة طبيعة حلزنة الحامض النووي الفايروسي وهل هو مزدوج أم مفرد الخيط وذلك من خلال تعريض الحامض إلى درجات حرارية متصاعدة. تسبب الأشعة فوق البنفسجية تلفا للحامض النووي الفايروسي رغم أنها أشعة غير مؤينة وذات طاقة ضعيفة لا تستطيع تفكيك غالبية الأواصر في الحامض المزدوج وبالتالي لا تتمكن من انتزاع الالكترونات كليا منه ولكنها تسبب استثارة الالكترونات فتزداد طاقتها لمستوى أعلى، وبعد إزالة الاستثارة تعيد الالكترونات تنظيمها على نحو مختلف عن حالة استقرارها السابقة مما يسبب تغيرات تركيبية في الحامض النووي، وأكثر أنواعها تأثيرا هي الأشعة التي يتراوح طولها الموجي بين 300-200 نانومتر وبطاقة كوانتمية قدرها 4,9 إلكترون فولت (ev) وهي طاقة تؤثر على البيريميدينات خاصة وتسبب تكوين "مثنيات" Dimers بين نيوكليوتيدتين متجاورتين وقد يصبح هذا المشى مدمرا للحامض لأنه يمنع تضاعفه ويحصل ذلك في الدنا مع قاعدة الثايمين خاصة كما أنه يسبب التواء غير طبيعي في سلسلة الحامض مما يجعل استنساخه صعبا جدا.

3. تأثير الضوء المرئي

الضوء المرئي هو الضوء الواقع بين الطولين الموجيين 390-760 نانومتر وهو عادة غير مؤثر على الاحماض النووية الفايروسية بكل أنواعها ولكن هناك أدلة بوجود تأثير توهيني للضوء الأزرق على الحامض النووي لفايروس موزائيك التبغ (TMV) ويليه الضوء الأحمر أما الضوء الأقل تأثيرا فهو الأخضر. إلا أن للضوء المرئي تأثيرا ايجابيا فهو يساعد في إصلاح ضرر الدنترة الناتجة عن تأثير الأشعة فوق البنفسجية حيث يعيد ازدواجية الخيطين أيا كان نوع الحامض النووي وتعرف هذه الظاهرة "التنشيط الضوئي" Photoreactivation أو "الإصلاح الضوئي" Light repair حيث يعمل الضوء المرئي وخاصة عند الطول الموجي 400 نانومتر على تنشيط إنزيم مختص يزيل حالة "المثنى Dimer التي تسببت عن تأثير الأشعة المذكورة ويعيد الحامض إلى حالته المزدوجة الطبيعية، النوع الأخر من إصلاح الحامض النووي المزدوج المدنتر هو "إصلاح الظلام" Dark repair حيث يوجد إنزيم متخصص خلوي يستحث في الظلام ويعمل على إصلاح الحامض المدنتر بإزالة حالة "المثنى" وقطع عدد من النيوكليوتيدات الإضافية من أحد الخيطين لذلك يسمى بأنزيم القطع Excision enzyme، بينما في حالة الإصلاح الضوئي يزال المثنى فقط ثم يقوم إنزيم الإصلاح بإعادة بناء المنطقة المقطوعة اعتمادا على تعاقب الخيط المقابل المكمل. تحصل اليتي الإصلاح المذكورتين في كل الخلايا الحية ومع الدنا الخلوي ولكن لا يعرف هل تستفيد منها فايروسات النبات ذات الدنا أو الرنا المزدوج عند وجودها في خلايا النبات في حالة تعرضها إلى حالة انفكاك خيطي المزدوج.

 4. تأثير الأشعة المؤينة

تشمل الأشعة المؤينة كل أنواع الأشعة الكهرومغناطيسية التي يقل طولها الموجي عن 100 نانومتر ومنها الأشعة السينية X-ray وأشعة كاما وهي فوتونات منبعثة وأشعة بيتا وهي الكترونات منبعثة والإشعاع الذري المكون من مزيج ألفا وبيتا والبروتونات، وتؤثر كل هذه الأنواع من الأشعة تأثيرا مدمرا على الأحماض النووية الفايروسية بأنواعها حيث تفك ارتباط خيطي الحامض المزدوج ثم تكسر الخيط المفرد وكما موضح في الشكل (2).

إن البيورينات والبيريميدينات هما الأكثر تأثرا بالأشعة المؤينة مقارنة بالرايبوز أو الفوسفات ولا يعرف بالضبط تأثير هذه الأشعة على الفايروسات عند تعريض النبات المصاب إليها مباشرة، وقد بدأ الباحثون هذه التجارب منذ منتصف أربعينات القرن العشرين حين عرضت نباتات التبغ المصابة بفايروس موزائيك التبغ (TMV) للأشعة السينية بطاقة 5000 رونتجن (R) ووجد إن فترة تشعيع 80 ساعة بعد التلقيح أوقفت فاعلية الفايروس بسبب امتصاصه لها وكان دليل حصول تأثير للأشعة على الفايروس هو تغير نوع الأعراض المعتادة بظهور بقع مصفرة بدل الموزائيك مما يدل على حدوث طفرة في الفايروس، كذلك تسبب الأشعة إنتاج إنزيم البيروكسيديز والجذور الحرة Free radicals التي يستمر تراكمها باستمرار التشعيع لتصل إلى مستوى تتلف فيه الفايروس ويعد هذا تأثيرا غير مباشر للأشعة السينية على الفايروس، ويمكن تقليل تأثير الأشعة المدمر بإضافة بروتينات أو أحماض نووية خلوية للمحلول الفايروسي أو إضافة المرق المغذي أو الجيلاتين حيث تتنافس على الجذور الحرة. لا يؤثر الإشعاع على المحلول الفايروسي المجمد أو الجاف، ويزداد تأثيره بمقدار عشرة أضعاف بوجود أملاح الفوسفات و كلوريد الصوديوم و الكلوروفورم وخلات الصوديوم.

الشكل (2): تأثير الاشعة المؤينة على الحامض النووي المزدوج حيث تكسر احد الخيطين المزدوجين

التشعيع ووحدات قياسه

التشعيع هو انطلاق حزمة من الطاقة الكوانتمية التي تمتصها الإلكترونات في الجسم المستقبل للأشعة مما يسبب تغيرا كيميائيا فيها في حالة كفاية الطاقة المنتقلة من الأشعة إلى تلك الإلكترونات، تقاس الطاقة الكوانتمية بالفولت الالكتروني ev) Electron Volt) وهي طاقة الإلكترون المعجلة بفرق جهد قدره فولت واحد، ولكل أشعة طولها الموجي وطاقتها الكوانتمية (الكوانتا) Quanta، وتعرف وحدة قياس الإشعاع "بجرعة التشعيع الممتصة" , RAD Radiation Adsorbed Dose وتساوي 6x10 فولت الكتروني ويقاس النشاط الإشعاعي للمواد المشعة بوحدة كوري" Cl) Curi) وهي مقدار تحلل غرام من الراديوم /ثانية وهي وحدة عالية في الاستعمالات الحيوية لذلك تستعمل وحداتها الفرعية وهي "ملليكيوري" (Millicuri (mci "ميكروكيوري Mci) Microcuri)، ويستعمل جهاز كيكر - مولر" Geiger-Muller المتكون من الكترودين متحسسين لقياس مستويات الإشعاع العالية أما مستويات الإشعاع المنخفضة جدا فتقاس بإذابة العينة في مذيب يحوي مادة ومضنية FIouroscent Compound ثم استعمال تقانة "العد بالومض السائل" Liquid Scintilation Counting.