التكشف المباشر للنباتات (الاكثار الدقيق)

تسمى البراعم الموجودة على أي جزء من النبات غير الساق بالبراعم العرضية، وتعتبر عملية تكوين تلك البراعم من العمليات المعقدة في الإكثار الدقيق ويرجع ذلك إلى ضرورة حدوث العمليات التالية:

1. إحداث تغيرات في الارتباطات الطبيعية الموجودة بين الخلايا والأنسجة.

2. إعادة الخلايا المتكشفة إلى حالة عدم التكشف ثم دفعها للتكشف مرة أخرى. إذا لم يتكون كالس قبل تكوين العضو الجديد سميت الطريقة بالتكشف المباشر أما إذا تكون الكالس قبل العضو الجديد سميت بالطريقة غير المباشرة.

3. دفع الأنسجة لتكوين عضو جديد.

4. نمو وتطور العضو الجديد.

يوجد في الطبيعة العديد من النباتات التي تحمل براعم عرضية مثل Begonia و Bryophyllum ويمكن دفع هذه البراعم للنمو وتكوين نباتات بزراعة الأوراق التي تحمل هذه البراعم والأكثر من هذا أن أوراق نبات Agava americana والتي لا تحمل براعم عرضية عند وجودها على النبات يمكن بتقسيمها وزراعتها في بيئة عادية استحثاث تكوين براعم عرضية عليها تنمو وتعطى نباتات كاملة وبالمثل فإن الأجزاء النباتية المختلفة المصدر والكبيرة الحجم نسبياً والمنزرعة معمليا يمكن أن تحفز لتكوين براعم عرضية أو أجنة جسدية أو حتى براعم زهرية على النسيج المنزرع مباشرة وبدون تكوين الكالس.

لكن لا يضمن ذلك عدم حدوث تغييرات وراثية وإن كان معدلها اقل بكثير بالمقارنة بالتكشف غير المباشر وربما يكون من الصعب تجنب وجود أشطاء عرضية حتى في حالة الإكثار بالعقد الساقية أو القمم النامية (1996 ,Bhojwani & Razdan). ويلاحظ أن الأجزاء المنزرعة صغيرة الحجم تميل غالباً إلى تكوين الكالس ولا تتكشف مباشرة.

وعادة تكون نسبة تكشف الأجنة أقل نسبياً من تكشف الأشطاء. وأمكن تحديد الظروف المثلى لإكثار عديد من النباتات بطريقة التكشف المباشر. وتلعب نوعية وتركيز ونسبة الأوكسينات والسيتوكينينات المستعملة دورا هاما في الإكثار بهذه الطريقة. لكن يلعب عمر المُستأصل النباتي دورا حرجاً في التكشف المباشر حيث يثير المرجع السابق إلى فقد القدرة على تكشف الأشطاء المباشر من الأوراق الفلقية لنباتات Brassica juncea بعد 10 أيام من الإنبات، وكانت أعلى ما يمكن من بادرات عمرها خمسة أيام.

كذلك فقدت الأوراق الفلقية لبادرات Pinus radiate هذه القدرة بعد ثلاث أيام من الإنبات وصاحب ذلك اختفاء اللبيدات منها، لكن تحقق أعلى معدل من التكشف للأوراق الفلقية لأشجار P. gerardiana عندما زرعت المُستأصلات من البذور قبل الإنبات.

من الثابت صعوبة عملية تكشف النباتات من الخلايا الفردية أو البروتوبلاست وكذلك من الكالس بالمقارنة مع تكشف الأعضاء الكاملة خاصة تلك حديثة التكوين كالأوراق الفلقية، أو السويقات الجنينية والأجنة غير كاملة التكوين. ولعل هذا هو السبب في قلة استخدام البروتوبلاست كوسيلة لإدخال جينات جديدة للخلية النباتية. كذلك يشير (1996 ,Bhojwani & Razdan إلى استخدام التكشف المباشر للأعضاء والأجنة الجسدية كمادة للانتخاب الوراثي حيث أن النباتات المتكشفة تشتمل على بعض الاختلافات الوراثية والتي تعرف بـsomaclonal variations . وقد تتكشف الأشطاء أو الأجنة الجسدية somatic embryo من خلايا ميرستيمية حيث تنشط بعض الخلايا في الانقسام خلال يومين من الزراعة ويزيد معدل الانقسام حتى تتكون بدايات المراكز الميرستيمية. وتسمى كتلة الخلايا الميرستيمية الكروية الشكل والتي تنتج من انقسام خلايا النسيج المنزرع بmeristemoids وتتكون هذه المراكز بصورة عشوائية في النسيج المنزرع كما هو موضح بالشكل رقم (1).

لكن لا يعرف بصورة واضحة ما إذا كان مركز الميرستيم ينشأ من خلية واحدة أو أكثر. وهناك دراسة تشير إلى إمكانية تكوين مركز ميرستيمى من خلية واحدة من خلايا البشرة وتكشف من هذا المركز 22 ساق. ويمكن القول إن البرعم المتكشف ناتج من خلية واحدة لو كانت هناك طفرة من النوع solid mutant بعد معاملة النسيج بإحدى المطفرات. أما إذا كان الفرع المتكشف به كيميرا فإن التكشف يحدث من عدد من الخلايا المختلفة الناتجة من انقسام خلايا مختلفة. لكن من الجدير بالذكر أن الطفرات قد توجد أيضا حتى في النباتات الناتجة من خلية واحدة لحدوث طفرات أثناء الانقسام .George & Gahan, 2008.

شكل 1: (أ) تكوين المراكز الميرستيمية والمشار إليها بأسهم بصورة عشوائية في المُستأصل النباتي المنزرع من أعناق أوراق نبات Echinacea purpurea

(ب) صورة مكبرة (المستقيم الموضح طوله 50 ميكروميتر)

(جـ) التكشف المباشر للأشطاء من أوراق Ruta gravoelens

وقد تتكون براعم عرضية أحياناً على أوراق النباتات الموجودة داخل المزرعة عندما تنثني الأوراق لأسفل وتلامس سطح البيئة. وهذه طريقة سهلة وجيدة لإكثار العديد من النباتات خاصة إذا كانت الأجزاء المسنة لها القدرة على تكوين براعم عرضية. كذلك فإن عدم انفصال المرحلة الأولى من زراعة الأنسجة كما قسمها Murashige عن المرحلة الثانية يعتبر ميزة فبمجرد نقل الجزء المنزرع إلى البيئة

يحدث التكشف. ويمكن استمرار تقسيم الأجزاء الناتجة وزراعتها في نفس البيئة للحصول على عدد أكبر من الأشطاء. ولزيادة معدل إنتاج البراعم يمكن فصل عدة مجموعات منها بعد تكوينها في البيئة الشبه صلبة ونقلها إلى بيئة سائلة حيث تسبب الحركة المستمرة للبيئة تفتيت المراكز الميرستيمية وتكوين العديد منها. وبعد تكوين الأشطاء تنقل إلى بيئة شبه صلبة للتجذير. ويذكر (1987) Pierik أن هذه الطريقة على نطاق تجارى لإكثار بعض النباتات مثل Saint pulia و Gerbera و Begonia و Cacti و Lilium .

ومن الناحية النظرية يمكن بطريقة ما دفع الخلية النباتية إلى أن تستعيد قدرتها على تكوين جنين دون الحاجة لوجود الجهاز الخاص بتكوين وتطور الجنين. وعمليا ليست كل خلايا النسيج المنزرع مؤهلة من الناحية الوراثية وتم تحديدها مسبقا لتسلك هذا المسلك من التكشف. وتعمل ظروف الزراعة المعملية المثلى على دفع الجينات المسئولة عن ذلك للتعبير عن نفسها، ولا يعرف حتى الآن على وجه الدقة ما إذا كانت كل خلايا انسجة النيوسيلة مؤهلة لتكوين أجنة جسدية أم لا، لكن تحتفظ أنسجة النيوسيلة بالقدرة على إنتاج أجنة جسدية لمدة طويلة عند زراعتها معمليا . ويمكن أن يطلق على التراكيب الميرستيمية والمعروفة بـprotocomm التي تتطور أثناء إكثار بعض أنواع الأوركيد أجنة جسدية.

ورغم الاعتقاد الكبير في تشابه العمليات الحيوية أثناء تطور الأجنة الجسدية مع الأجنة العادية فإن بعض الأبحاث تثبت وجود تباين على المستوى الخلوي وفي المشابهات الإنزيمية وكذلك في البروتينات التي تخلق أثناء ذلك. وحتى الثمانينيات من القرن الماضي كانت الأبحاث مهتمة بتحديد العوامل التي تشجع تكوين تراكيب تشبه الجنين الجسدي. وعند الانتقال إلى المجال التطبيقي لاستخدام الأجنة الجسدية في الإكثار اتضح أن أغلبها غير قادر على الإنبات لعدم نضجها من الناحية الوظيفية والكيموحيوية، ومن هنا كانت الأبحاث في العقد التالي حول إدراج مرحلة النضج للأجنة بعد تكوينها (2008 ,Von Arnold). وهناك توجه الكبير في الاعتماد على الإكثار بالأجنة الجسدية سواء بالطريقة المباشرة أو غير المباشرة كبديل عن تكشف الأشطاء بصرف النظر عن الثبات الوراثي لأنها تقلل كثيراً من تكاليف الإنتاج لإمكانية استعمال الميكنة. وبقى القول أن لدراسة تكشف الأجنة في مزارع القوارير أهمية كبيرة في إلقاء الضوء على الأساس الخلوي لعملية التكشف والتطور في النباتات الراقية Razdan & Bhojwani) (1996)) و (2008 ,Von Arnold) و (2009 ,.Neumann et al).

الفرق بين تكشف الأجنة والأشطاء

في حالات كثيرة يكون من الضروري تحديد طريقة التكشف للنباتات المستولدة هل هي بالتكشف المباشر أو غير المباشر (شكل رقم 2) لأهمية ذلك في برامج التربية على سبيل المثال. ويمكن التفريق بين النباتات الناتجة من تكشف الأشطاء عرضياً وتكشف الأجنة الجسدية على أساسين:

شكل 2: رسم تخطيطي يبين الفرق التشريحي بين النهاية القاعدية للجنين (1، 6،4) وللأشطاء (2،3،5) في القوارير وفي النبات الطبيعي. الخطوط المتقطعة تشير إلى الأوعية الناقلة في العضو (1996 Bhojwani & Raza).

1. يبدأ تكشف الأجنة سواء الجسدية أو الجنسية من خلية واحدة ويبين شكل رقم (3) مراحل تكوين الأجنة الجسدية في نباتات الجزر ومن ثم يلاحظ وجود القطبية في الجنين المتكون أي وجود قمة ميرستيمية للأشطاء وأخرى للجذور. ويكون هناك اتصال مغلق للأوعية الناقلة بين المجموع الخضري والجذري. أما الأشطاء المتكشفة عرضياً فلا تحتوي على قمة ميرستيمية للجذور لكن من الممكن ان تتكون الجذور عرضيا في مرحلة لاحقة لتكشف الأشطاء كما في الشكل (4).

شكل 3: مراحل تطور تكوين الأجنة الجسدية في الجزر (1991 ,Stafford & Warren)

2. لابد من وجود البروتينات المميزة للأجنة في الأوراق الفلقية للأجنة الجسدية المتكشفة على العكس من أوراق الأشطاء المتكشفة عرضيا. وتوضح دراسة (1997) .Maria de los et al على تكشف الأجنة الجسدية من نباتات قصب السكر هذا التغيير في البرويتن حتى في مرحلة تكوين الكالس.

3. وعلى الرغم من الاعتقاد بأن الأجنة الجسدية تنشأ من خلية واحدة والأشطاء تتكشف من عدد من الخلايا فإن بعض المشاهد تمثل عدم إنتاج أشطاء تتضح بها ظاهرة الكيميرا عقب تعريض النبات الأم للإشعاع مثلا، وكذلك إنتاج نباتات محورة وراثياً بنقل الجينات إليها بالوسائل المختلفة حيث ينقل الجين إلى خلية واحدة تشير إلى أن الأشطاء قد تنشأ من خلية واحدة في بعض الحالات. وفي الوقت الذي يعتبر فيه تكوين الأجنة الجسدية غير المباشرة ذو أهمية كبرى في الإكثار الخضري فإن تكوين الأجنة المباشر غير فعال في الإكثار وذلك لانخفاض معدل تكوينها وتكوين أجنة ثانوية تلتصق بها وتشوهها أو تعيق إنباتها. ولسهولة إنتاج الأجنة الجسدية بالمعلق الخلوي فإنها تقلل من استعمال الأيدي العاملة في عمليات الزراعة المختلفة ويمكن من استخدام الطرق الآلية في الإكثار الخضري، مما يقلل من التكاليف.

شكل 4: قطاع في كالس نبات Cephaelis pecacanha يوضح التكشف غير المباشر للجنين الجسدي (1 ،2) يلاحظ وجود بداية تكوين قمة الجذر rp والأوعية الناقلة pvs في المجموع الخضري ويلاحظ الاتصال بينهما، (3) مراحل مختلفة من إنبات الأجنة، (4) نبات كامل بعد الأقلمة (المستقيم الموضح يمثل طول 100 ، 100 ميكروميتر، 20، 20 مم على التوالي) (2000 ,.Rout et al).