التكشف غير المباشر في مزارع الكالس

لقد حظي تكوين الكالس ومن ثم المعلق الخلوي بدراسة العديد من العلماء وقد صنف (1998) Collin & Edwards كتابا في مزارع الكالس والمعلق الخلوي والتطبيقات العملية لهذا في الإكثار الدقيق عبر تكوين الأجنة الجسدية بالإضافة إلى إنتاج المواد الثانوية في المفاعلات الحيوية. يستهل تكوين الكالس بارتداد الخلايا المتكشفة للمستأصل النباتي إلى حالة عدم التكشف وهذا الارتداد غاية في الأهمية حيث أنه يعطى الخلايا البالغة المتكشفة فرصة للتعبير عن تركيبها الوراثي الخاص بإعادة التكشف وللخلايا التي ما زالت في طور الانقسام المقدرة على الارتداد إلى الحالة الميرستيمية وتكوين الكالس بدرجة أعلى من تلك المتكشفة. وتتحكم منظمات النمو الداخلية والخارجية المضافة إلى وسط النمو بدرجة عالية في هذا الارتداد والانقسام، وبتأثير تلك العوامل خاصة منظمات النمو قد تستمر الخلايا في مرحلة تكوين الكالس وعدم التكشف أو تدخل مرحلة التكشف Neumann et al (2009. ويترتب على ذلك الانقسام تكوين كتلة غير متميزة من الخلايا يطلق عليها الكالس.

وتستجيب أغلب الأجزاء النباتية للنباتات ذات الفلقتين في القوارير للظروف المشجعة لتكوين الكالس على العكس من ذوات الفلقة الواحدة حيث يقتصر تكوين الكالس على الأجنة، والأوراق حديثة التكوين، والعقد الساقية، وكذلك النورات الزهرية. وكانت بداية تكوين الكالس في مزارع الأنسجة في عام 1939 عندما لاحظ Gautheret تحول الأجزاء التي تم زراعتها من أنسجة جذور الجزر في وسط غذائي يحتوى على أملاح معدنية وجلوكوز وبعض الفيتامينات و IAA إلى كتلة غير متكشفة من الخلايا. ولم تكن لهذه الخلايا آنذاك فائدة تطبيقية في الإكثار الدقيق للنباتات، إلا أنه بتقدم زراعة الأنسجة استطاع كثير من الباحثين إنتاج أشطاء من كالس العديد من النباتات باستخدام أجزاء نباتية مختلفة متضمنة أنسجة الكامبيوم، اللحاء، القشرة، النخاع بل ومن أنسجة الخشب أحياناً. وتقسم مراحل نمو الكالس إلى ثلاث مراحل على أساس عدد الخلايا في العشيرة وأيضها وبلوغ الكالس شكله النهائي، وهذه المراحل هي:

1. مرحلة الاستحثاث Induction: وهي عملية إعداد الخلية للانقسام وتتميز بنشاط أيضي عالي وتخليق بعض الجزيئيات الدقيقة الضرورية للانقسام.

2. مرحلة الانقسام :Division وفيها تتحول الخلية غير الميرستيمية إلى خلية ميرستيمية ذات معدل انقسام عالي ويقل فيها متوسط حجم الخلايا.

3. مرحلة التكشف Differentiation: حيث تحدث زيادة في حجم الخلايا ويزيد حجم الفجوات العصارية ويقل معدل المواد المسئولة عن الانقسام ويحدث اتزان بين عمليتي الانقسام والاستطالة. ويعترض البعض على استعمال مصطلح differentiation في هذه المرحلة حيث أن التغير الحادث يكون مجرد تغيير سيتوبلازمي فقط دون تغيير واضح في الشكل الظاهري -كما يعنى المصطلح- لكن بالطبع تقود هذه التغيرات السيتوبلازمية في النهاية إلى تكشف الخلايا وتميزها كأن تتحول بعض خلايا الكالس على سبيل المثال إلى خلايا خشب. ويعتبر تكشف بعض الخلايا إلى خلايا خشب خطوة أولى في تكشف الكالس إلى أشطاء أو جذور.

وقد بينت دراسة (1970) Thorpe & Murashige على تكشف كالس نباتات الدخان وجود تباين على مستوى الأحماض الأمينية والبروتينات والكربوهيدرات في الكالس غير المتكشف وذلك المتكشف. ورغم أن خلايا نوعي الكالس كان ذات محتوى متماثل من DNA فإن خلايا الكالس المتكشفة احتوت على تركيز أعلى من RNA والبروتين. وكذلك سجل اختلاف كبير في محتوى الخلايا من النشا ومن المعروف أن لتجميع النشا في الخلايا دوراً واضحاً في تكشف الأشطاء حيث لاحظ ما يلى: أ) حدوث تجميع كثيف للكربوهيدرات في الخلايا التي تتحول إلى خلايا متكشفة دون غيرها. ب) لا تتكون المراكز الميرستيمية في المناطق التي تعاني من نقص تراكم النشا. ج) يسبق ترسيب النشا في الخلايا مظاهر عملية التكشف ويصل أعلى تركيز بعد 11 يوم من استهلال الزراعة بدء تكوين المناطق الميرستيمية بعد ذلك بثلاثة أيام. د) إذا تم معاملة الكالس بحامض GA3 فإن تكوين المناطق الميرستيمية يُثبط أمنع الحامض السابق عملية تخليق النشا وبالتالي لا يصل تركيزه إلى الحد الضروري للتكشف. وربما يعمل النشا والسكر المضاف للبيئة كمصدر الطاقة الضرورية لعملية التكشف. ويلخص (1996 ,Bhowani & Razdan نتائج تجارب أخرى مشابهة تبين سرعة عملية التنفس مع زيادة تركيز العديد من الإنزيمات مثل phosphatase و ATPase و succinate dehydrogenase مع زيادة تخليق البروتين وانخفاض محتوى اللبيدات والسكريات الذائبة.

يتم الحصول على الكالس بتعقيم النسيج النباتي ثم نقله إلى البيئة المغذية الشبه صلبة عادة، وغالباً تحفظ المزرعة في الظلام. ويمكن بعد ذلك نقله واستمرار نموه في بيئة سائلة. وتختلف قدرة النباتات على تكوين الكالس اعتماداً على العوامل المؤثرة على النمو والتكشف في زراعة الأنسجة، لكن عموماً قدرة النباتات على تكوين كالس أعلى من قدرتها على التكشف. ورغم أن البيئة التي استعملت في البداية لتكوين الكالس كانت بسيطة التركيب إلا أن البيئات المستعملة الآن معقدة ولابد أن يضاف إليها بعض منظمات النمو وخاصة أحد الأوكسينات IAA, NAA, 2,4-D))، ويختلف التركيز من 0.01-10 ملجم/ لتر من نوع نباتي إلى آخر. وتختلف المدة اللازمة لتكوين الكالس من عدة أيام إلى عدة أسابيع. وبفحص التغير في الشكل العام لكالس الدخان وجد أن معظم النمو يحدث في المنطقة الملاصقة للبيئة. وباستمرار النمو يحدث اختلاف في معدل نمو وتضاعف الخلايا في الأجزاء المختلفة من الكالس. ومن المعروف أن زيادة عدد وحجم الخلايا البكتيرية والفطرية تتم عقب الطور التضاعفي مباشرة ويتوقف معدل النمو الخارجي للمستعمرة على مقدار الإمداد بالمواد الضرورية للنمو. وبهذا يكون معدل النمو في المحيط الخارجي للمستعمرة خطياً، أما في الكالس فإن معدل النمو قد لا يكون خطياً لأن النمو والانقسام يحدثان نتيجة لتأثير الجرح كما سبق ذكره.

في الغالب تكون خلايا الكالس غير متماثلة بوجود أكثر من نوع من الخلايا في نفس الكالس قد تكون احدها ذات قدرة على التكشف دون الأخرى. وهذا التباين يمكن أن يكون في اللون، الشكل الظاهري، التركيب، النمو، أو عمليات الأيض، فحتى الكالس الذي يبدو أنه متماثل تماماً في المظهر الخارجي قد يحتوى على بعض الخلايا ذات النشاط الأيضي المختلف. وربما يرجع هذا التباين إلى اختلاف التركيب الوراثي حتى داخل نفس النوع أو اختلاف الأنسجة التي كونت الكالس، أو لتأثير الظروف البيئة ومكونات البيئة. ويمكن للخلايا ذات القدرة على التكشف الاحتفاظ بهذه القدرة فترة طويلة ويقف نشاط الخلية كأن تحفظ في النتروجين السائل بطريقة خاصة، لكن باستمرار الزراعة في القوارير قد تتراكم بعض التغييرات الوراثية التي من شأنها أن تفقد الخلية القدرة على التكشف (1993) ,George). ويلاحظ في حالة استعمال عضو نباتي مثل الجذر لتكوين الكالس أن خلايا الكالس المتكونة من الخلايا المختلفة في الجذر ليست لها نفس القدرة على النمو وربما يطغى أحد هذه الأنواع على الطرز الأخرى وتكون هي السائدة في الكالس. ويتبين من ذلك أن الكالسين المتكونين من نفس النسيج والناميين في بيئتين مختلفتين لا بد وأن ينظر لهما على أنهما سلالتين مختلفتين. ويجب العمل على إيجاد الظروف المثلى للحد من درجة التباين التي توجد بين خلايا الكالسات المختلفة والخلايا في نفس الكالس. وإذا كان برنامج الإكثار الدقيق معتمدا على الكالس، فإن الكالس لابد أن يفي بشرطين أساسيين هما الاحتفاظ بالقدرة على التكشف باستمرار التقسيم والنقل إلى بيئة جديدة والثبات الوراثي.

يتوقف الشكل الظاهري للكالس على أسلوب نموه فباستمرار نمو الكالس يتم دفع الخلايا إلى أعلى والخارج بعيداً عن سطح البيئة. وعلى ذلك يحدث تدريج في تركيز المواد الغذائية ومكونات البيئة والغازات في الخلايا بالقطاعات المختلفة من الكالس. ويحدث أيضاً تدريج في تراكم نواتج عمليات البناء فالخلايا الملاصقة للبيئة تفقد تلك المواد أسرع من الخلايا البعيدة عن سطح البيئة. ويؤثر حتما التدريج في توزيع المركبات المختلفة بطريقة إيجابية أو سلبية على أسلوب نمو وتكشف الكالس. ويمكن تقليل التباين الحادث في الكالس والحصول على درجة عالية من التماثل بإتباع نظام محدد ودقيق لتقسيم وإعادة زراعة الكالس على فترات قصيرة بحيث تتم زراعة الأجزاء المتماثلة ظاهرياً. ومعدل نمو الخلايا في المعلق الخلوي يكون سريع جدا بالمقارنة مع خلايا الكالس في البيئة شبه الصلبة كما تكون درجة التشابه بين الخلايا في المعلق الخلوي عالية. وتلك من المميزات التي تجعل المعلق الخلوي يستخدم في بعض الأغراض التي لا يفضل فيها استخدام الكالس.

في معظم الحالات يتم الحصول على الكالس بوضع الجزء النباتي في بيئة شبه صلبة محتوية على تركيز عالي من الأوكسين وتركيز منخفض من السيتوكينينات. وقد يتم تقسيم ونقل الكالس المتكون مرة أو أكثر إلى بيئة جديدة بنفس التركيب بغرض استمرا النمو. أو ينقل الكالس إلى بيئة أخرى مختلفة في محتواها من منظمات النمو فيضاف تركيز أعلى من السيتوكينينات وأقل من الأوكسين لإحداث التكشف. ولما كان الكالس الناتج من نفس الجزء المنزرع غير متجانس في صفاته ومنها قدرته على التكشف غالباً، فإنه يجب العمل عند تقسيم ونقل الكالس استعمال الأجزاء التي يعتقد أنها مناسبة دون غيرها. وذلك لأنها قد تعيق وتنافس الأجزاء ذات القدرة على التكشف. وقد اتضحت هذه الظاهرة في إكثار نباتات Pelargonium وغيرها من النباتات (1977 Holdgate). لكن يتطلب انتخاب الكالس المتسم بالقدرة على التكشف خبرة عالية، وعموما الكالس ذو المظهر المائي المفكك friable أقل قدرة على التكشف من الكالس المتماسك compact أو المتكون عليه عقد organsed callus. ويعيب استعمال الكالس كطريقة للإكثار زيادة معدل حدوث تغير وراثي، لكن إذا أمكن التحكم في هذا المعدل فمن الممكن الاعتماد على الكالس في الإكثار الخضري.

لوحظ زيادة في سرعة نمو الكالس إذا نقل بعد تفتيته إلى أجزاء صغيرة إلى بيئة سائلة. وتم استخدام هذه الطريقة للإسراع في الإكثار الخضري لعدد من النباتات. فعلى سبيل المثال، إكثار نبات Hemerocallis بطريقة التكشف غير المباشر يتطلب 135 يوم من بدء الزراعة حتى نقل النباتات إلى الحقل. وتعتبر الفترة اللازمة لتكوين الكالس ذو القدرة العالية على التكشف هي الأطول في هذا البرنامج، وأمكن تقليل المدة اللازمة للإكثار بنقل الكالس المتكون في البيئة شبه الصلبة إلى بيئة سائلة للإسراع في إكثاره وبعد زيادة العدد يتم نقل كتل الكالس المتكونة إلى البيئة شبه الصلبة مرة أخرى لدفعه للتكشف. لكن التركيز المطلوب من منظمات النمو لدفع الكالس إلى تكوين المعلق الخلوي أي تفكك الخلايا يكون عالي بالقدر الذي يثبط التكشف بعد ذلك. والمشكلة الأخرى أن التغيرات الوراثية تزيد بطول المدة من الزراعة حتى التكشف (1987 ,Pierik).

التكشف غير المباشر للأشطاء

بعد اكتشاف السيتوكينينات أوضح كلا من Miller في سنة 1955 و Skoog في سنة 1957 أن الكالس المتكون من أنسجة نبات الدخان قد يستمر على حالته دون تكشف أو يتكشف منه جذور أو أشطاء عند إضافة نسب محددة من السيتوكينينات والأوكسينات إلى بيئة النمو، حيث تشجع هذه الظروف تحويل الخلية إلى الحالة الميرستيمية واستعادة قدرتها على التكشف فإذا كانت نسبة السيتوكينينات إلى الأوكسينات مرتفعة فإن ذلك يدفع الكالس إلى تكشف أشطاء والعكس يشجع تكشف الجذور، أما التركيز المتوسط من الأوكسينات والسيتوكينينات يشجع استمرار نمو الكالس على حالته.

ويعد عمر الكالس عاملاً هاماً في التكشف حيث تفقد كالسات معظم الأنواع النباتية قدرتها على التكشف بعد فترة من زراعتها مع وجود تباين وراثي في قدرة الكالس على التكشف. وتجدر الإشارة إلى أنه إذا كانت البيئة مشجعة لتكوين جذور فهي غالباً غير مناسبة لتكشف الأشطاء ، وبصفة عامة فإن قدرة الكالس على تكوين جذور أعلى من قدرته على تكوين أشطاء. لكن ربما تتكشف أشطاء وجذور في نفس البيئة لكن دون أن يكون بينهما ارتباط تشريحي في الأوعية الناقلة غالباً تنتج الأجزاء الميرستيمية للبادرات حديثة الإنبات كالسات لها قدرة أعلى على التكشف على العكس من الأجزاء غير الميرستيمية للأعضاء المسنة وتحت نفس الظروف قد يحدث تكشف للأجنة الجسدية والتي قد يظن أنها أشطاء لكن يميز النبيتات الناتجة من إنبات الأجنة الجسدية وجود الأوراق الفلقية والبروتين المميزة للأجنة وعادة ما يكون إنتاج الأشطاء من الكالس بطئ نسبياً في معظم النباتات، وغالباً تكون البيئة المشجعة لنمو الكالس مثبطة للتكشف المباشر. لكن في بعض الأجناس يحدث تكشف في الكالس تحت نفس ظروف الزراعة. تعطى النباتات ثنائية الفلقة كالس ذو قدرة تكشفيه عالية وذلك من أجزاء نباتية متباينة كأجزاء الورقة السوق الجذور، الأجزاء المخزنة، قمم الأفرع، أنسجة البادرات (1993 ,George). ويوضح الشكل التالي مراحل الحصول على نباتات كاملة من كالس الأوراق الفلقية لنبات الطماطم.

أما في النباتات أحادية الفلقة فإن الأنسجة التي يمكن أن تعطى كالس ذو قدرة تكشفية تكون محدودة وغالباً تتركز في الأجنة، والأوراق حديثة التكوين، والعقد الساقية والأجزاء الزهرية غير الناضجة. أما في الأشجار فإن الأنسجة ذات القدرة التكشفية هي القريبة من الحزم الوعائية بالسوق والجذور. ومن الضروري أن تستخدم أنسجة ذات خلايا قادرة على الانقسام لارتباط ذلك بالقدرة على التكشف.

شكل يبين: مراحل زراعة الأنسجة لنباتات الطماطم . (1) الأوراق الفلقية في بداية تكوين الكالس، (2) تكشف الأشطاء اعتماداً على منظمات النمو الموجودة بالبيئة، (3) تكشف الجذور اعتمادا على منظمات النمو الموجودة بالبيئة، (4) نقل الأشطاء المتكشفة إلى بيئة التجذير، (5) أقلمة النباتات تحت الأغطية البلاستيكية، (6) النباتات المنقولة للحقل بعد الأقلمة.

الكالس المتعضون

سبق القول أن تكشف البراعم يتم من مراكز ميرستيمية تتكون عشوائيا بالكالس وبذلك تكون عرضة لحدوث تغيرات وراثية متباينة. لكن لوحظ أحيانا تكوين نوع من الكالس يطلق عليه organized callus أو semi-organized callus وتزيد احتمالية الحصول على هذا النوع من الكالس عند استخدام أنسجة ميرستيمية. وهذا الكالس عبارة عن كالس متكون من مجموعة من الخلايا الميرستمية السطحية التي توجد فوق مركز من الخلايا ذات الفجوات العصارية الكبيرة والتي تعمل كوسيلة لتدعيم وتغذية الخلايا الميرستيمية.

وتعمل ميرستيمات الطبقة الخارجية على تثبيط انقسام الخلايا الموجودة بالمركز. ومن أمثلة هذا النوع ، الكالس الناتج من زراعة القمم الميرستيمية لنباتات Rhdondrohn فيبدو الكالس كحبيبات ميرستيمية صغيرة خضراء اللون تتكشف بدورها إلى أفرع. كذلك الكالس المتكون في قواعد الأفرع في بعض مزارع الأشطاء. ويضمن هذا النوع من الكالس عدم حدوث تغير وراثي بمعدل مرتفع في النبيتات الناتجة. لكن تتوقف إمكانية الحصول على هذا النوع من الكالس على الطريقة المتبعة في الزراعة فيجب ألا تعمل منظمات النمو على سرعة انقسام الخلايا الموجودة بالمركز. وفقد الكالس المتعضون اذبات Anthurium هذه الصفة عند تقسيمه ونقله عدة مرات إلى بيئة جديدة. لكن باستبعاد الكالس غير المتعضون من الزراعة أمكن المحافظة على هذا التركيب مدة أطول وتكشفت أعداد أكبر من النباتات (1986) Geier. وقد استخدم الكالس المتعضون في إكثار نباتات القرنفل وذلك بتقسيم القمم النامية قبل زراعتها.

التكشف غير المباشر للأجنة الجسدية

قد تتكون الأجنة الجسدية بطريقة غير مباشرة أي بعد تكوين الكالس حيث تنقسم بعض خلايا النسيج المؤهلة وراثياً وتكون الجنين الجسدي. وتتكون الأجنة الجسدية داخلياً أو خارجياً على نسيج الكالس ، لكن يلاحظ في معظم الحالات أنها تتكون من كالس يشبه البراعم وهو ما يعرف بـ bud-like mass tissue وعلى العكس من تكشف الأفرع يتكشف الجنين من خلية واحدة ولهذا أهمية كبيرة في الإكثار الخضري لضمان عدم وجود كيميرا في النبيتات الناتجة وغالباً ينتج الكالس الذى له قدرة جزئية أو كلية على تكوين الأجنة الجسدية بطريقة غير مباشرة أثناء زراعة أنسجة ميرستيمية مثل الجنين الجنسي، النيوسيلة البادرات حديثة الإنبات، ومبادئ الأوراق والبراعم الزهرية. ويمكن القول إن الأجزاء القادرة على إنتاج الأجنة الجسدية بطريقة مباشرة قادرة أيضاً على إنتاج الأجنة الجسدية بطريقة غير مباشرة. لكن تقل تلك القدرة في معظم الحالات باستمرار تقسيم وإعادة زراعة الكالس يلاحظ من الناحية التشريحية أن مجموعة الخلايا التي تنقسم لتكون الجنين تكون منفصلة عن الخلايا المجاورة ويسهل إزالتها من الكالس في البيئة السائلة حيث تطفو على سطح البيئة. وتتميز هذه الخلايا بصغر حجمها وكبر النواة وعدم وجود فجوات عصارية وكثافة السيتوبلازم كما يبين الشكل التالي. تختلف سرعة ومعدل تكشف الأجنة الجسدية من الكالس باختلاف الأنواع النباتية فقد تتكون بسرعة وبمعدل عالي وربما تحتاج لمدة طويلة من بداية تكوين الكالس حتى تكوينها. وبصورة عامة يصعب الحصول على الأجنة الجسدية من كالس أو المعلق الخلوي للعديد من النباتات ويبين (2008) George & Debregh أن ذلك يتطلب من الناحية العملية ملاحظة ما يلي:

1. التباين الواسع بين الأنواع أو حتى بين الأصناف التابعة لنفس النوع.

2. كما هو الحال في تكشف الأجنة الجسدية بطريقة مباشرة فإنه في مرحلة تأسيس المزرعة يضاف إلى البيئة الأوكسينات التي يجب أن تزال كليا أو يخفض تركيزها إلى الحد الأدنى في المراحل التالية لأن الأوكسينات قد تقلل أو تمنع تكشف الأجنة الجسدية.

3. يجب أن يهتم بشدة بتركيز السكر في البيئة فقد لا تتكون الأجنة الجسدية إذا كان تركيزه عالياً. كذلك يفضل إضافة النيتروجين في صورة مختزلة كالأمونيا أو في صورة أحماض أمينية مثل الألانين أو الجلوتامين (1999 ,.Salajova et al) و (Wilson et al., 1996).

4. يعتبر بقاء المزرعة في مرحلة استحثاث تكوين الأجنة من المراحل الحرجة فطول هذه الفترة قبل إعادة التقسيم والزراعة قد يفقد الخلايا القدرة على تكوين الأجنة.

شكل يبين: على اليمين الطور القلبي للأجنة الجسدية المتكشفة من كالس نبات Echinacea purpurea بعد 21 يوم من الزراعة (المستقيم يمثل 320 ميكروميتر) (2000 ,.Choffe et al). وعلى اليسار تكشف الأجنة الجسدية في معلق الخلايا حيث يلاحظ وجود الأوراق الفلقية والقمم الميرستيمية للجذور.

لوحظ في بعض الحالات تكوين أجسام تعرف بالأبصال الكاذبة pseudobulbils تشبه الأبصال في شكلها المورفولوجي على الكالس ذو القدرة العالية على تكوين الأجنة الجسدية. هذه الأجسام عبارة عن أجنة جسدية في مرحلة النمو globular وتحت الظروف غير المحفزة لاستكمال تطورها إلى أجنة كاملة فإنها تزيد في الحجم وتفقد قدرتها على التطور. ويمكن استخدام هذه الطريقة في الإكثار المعملي للنباتات من المعلق الخلوي لضمان الحصول على عدد كبير نسبياً من النباتات، لكن التركيزات المرتفعة من الأوكسين اللازمة لتكوين المعلق الخلوي مثبطة لتكشف الأجنة الجسدية. هذا بالإضافة إلى إنتاج أجنة مشوهة ذات عدد أكبر من الأوراق الفلقية أو بها التحام مما يعيق إنباتها. ومع هذا فإن هذه الطريقة هي الأنسب من بين طرق الإكثار المعملي الأخرى لبعض النباتات وكثير من الأشجار الخشبية على وجه التحديد مثل نخيل الزيت والبن العربي (1992 Bajaj). لكن يعيق استعمال هذه الطريقة لإكثار عديد من النباتات بالإضافة إلى صعوبتها عدة أسباب منها:

1. هناك احتمالية عالية لحدوث طفرات.

2. فقد القدرة على تكوين الأجنة باستمرار تقسيم ونقل الكالس.

3. في بعض الحالات تتكون الأجنة لكنها تدخل في دور سكون عميق ويكون من الصعب كسره في بعض النباتات.

ويجب الإشارة إلى أنه ببدء تكوين الأجنة الجسدية قد تتوالى عملية تكوين الأجنة الجسدية الثانوية فيما يعرف بـ repetitive embryogenesis. ويطلق على الأجنة التي تتكون تباعاً polyembryony أو secondary embryo وذلك حيث تتغيب العوامل التي تمنع تكوين أجنة ثانوية عند تكوين الجنين الجنسي. ويمكن أن تتكون الأجنة الثانوية على محور الجنين الأصلي، وربما من خلايا محددة كالبشرة (McGranahan et al., 1988). وفى الغالب تكون النباتات الناتجة من تكشف الأجنة الجسدية بطريقة غير مباشرة عادية من الناحية الظاهرية وكذلك التركيب الخلوي، لكن قد تتكون أجنة مشوهة كما سبق القول. ويكثر حدوث ذلك عندما تتكشف الأجنة من كالس أو معلق خلوي تم تنميته لمدة طويلة، فنباتات القمح الخالية من الكلوروفيل والناتجة من الأجنة الجسدية بطريقة غير مباشرة زاد عددها طرديا مع زيادة عمر المزرعة George & Debergh (2008).