زراعة الخلايا النباتية

تعد تقانة زرع الخلايا النباتية إحدى تقانات زراعة الأنسجة النباتية المهمة لما لها من أهمية تطبيقية في العلوم الزراعية والصيدلانية، وتتصف الخلايا النباتية بخاصية الطاقة الخلوية الكامنة Totipotency وهي قدرة الخلايا على التجدد وتكوين نباتات كاملة. وهذا يزيد من أهمية زرع الخلايا النباتية حيث يمكن الحصول على نباتات وطفرات وسلالات جديدة لها أهمية تطبيقية في برامج التحسين الوراثي للنباتات ذات الأهمية الاقتصادية. كما يمكن استخدام الخلايا النباتية انتاج المواد الفعالة ذات الأهمية التطبيقية في الصناعات التجميلية والصيدلانية.

يتضمن تطبيق زرع الخلايا النباتية مرحلتين:

المرحلة الأولى: كيفية الحصول على معلق خلوي يحوي خلايا مستقلة بعضها عن بعض.

المرحلة الثانية: تتضمن زرع الخلايا ونموها للاستفادة من تطبيقاتها المختلفة.

كيفية الحصول على الخلايا الحرة:

يتطلب تحرير الخلايا النباتية فك الجدار البكتيني الذي يربط بين الخلايا مع المحافظة على الجدار الخلوي السيللوزي. يتم الحصول على المعلق الخلوي من الأنسجة النباتية المختلفة مثل الأوراق القمم النامية الجذرية والخضرية الأنسجة البارنشيمية، ومن خلايا الجنينية في البذرة. يتم الحصول على المعلق الخلوي بطريقتين:

1- الطريقة الميكانيكية: تتطلب هذه الطريقة تجزئة الأنسجة إلى قطع صغيرة في بادئ الأمر، بعد تعقيمها. ثم توضع في وسط مغذي يحوي تركيز عال من السكروز 40 غ /ل، ثم تطحن بشكل يدوي ضمن الوسط السائل. يتم الحصول على مزيج من الخلايا الحرة وخلايا مجزأة بأبعاد مختلفة بالإضافة إلى بقايا الأنسجة النباتية.

يفلتر المعلق الخلوي عبر فلاتر دقيقة 40-60 ميكرون) معقمة تحت جهاز العزل الجرثومي للتخلص من الأجزاء كبيرة الحجم من الأنسجة وتبقى الخلايا الحرة وبقايا الأنسجة صغيرة الحجم. يتم غسل المعلق الخلوي بوسط مغذي جديد ويثفل بهدف تنقية المعلق الخلوي.

طبقت هذه التقانة على حوالي 200 نوع نباتي أعطت نتائج إيجابية فقط على 27 نوع نباتي. وكانت نسبة الخلايا الحرة الحية الناتجة متفاوتة بين الأنواع ( Chaussat et Bigot, 1982 ).

يتم الحصول بهذه الطريقة على نسبة ضئيلة من الخلايا الحية التي لها قدرة على النمو والتطور، كما يتم الحصول على نسبة عالية من الخلايا المشوهة والمضروبة.

2- الطريقة الأنزيمية:

تستخدم في هذه الطريقة أنزيمات خاصة لفك الروابط البكتينية التي تربط بين الخلايا النباتية بهدف تحرير الخلايا الحرة ضمن المعلق الخلوي. يستخدم عادة أنزيم البكتينيز يضاف مع الوسط المغذي الخاص بالاستخلاص.

مثال على عزل الخلايا النباتية في أوراق التبغ:

تؤخذ أوراق تبغ من نباتات نامية في البيت الزجاجي، ثم تعقم الأوراق تحت جهاز العزل الجرثومي، وتقسم إلى أجزاء صغيرة، وتنزع البشرة السفلية لتسهيل هضم الأنسجة بالمحلول الأنزيمي، ويضاف للأجزاء النباتية وسط مغذي يحوي أنزيم البكتينيز بالإضافة إلى السكروز بنسبة 40 غ /ل والمحلول المعدني المغذي. وتترك لفترة من الزمن تختلف بحسب الأنواع النباتية.

بعد هدم الجدر البكتينية يتم غسل المعلق الخلوي بوسط جديد مغذي وخالي من المحلول الأنزيمي مرتين ويفلتر المعلق لتنقية الخلايا الحرة التي تصبح جاهزة لعملية الزرع.

تتصف هذه التقانة بكونها تعطي نسبة عالية من الخلايا الحرة ذات الحيوية العالية والغير مهشمة، كما يمكن الحصول على الخلايا الحرة مباشرة من الكالوس القابل للفرط friable callus.

وذلك عن طريق وضع جزء من الكالوس في وسط مغذي سائل مع التحريك المستمر، يتفكك الكالوس ويتم تحرير الخلايا الحرة. ويتم فصل الخلايا ضمن المعلق الخلوي بالفلترة لفصل الكالوس عن الخلايا الحرة (2008 ,.Gurel et al., 2002;Ngara et al).

زراعة الخلايا النباتية:

يختلف تركيب الأوساط المغذية الخاصة بزرع الخلايا النباتية بحسب الأنواع النباتية وحسب الهدف من زرع الخلايا النباتية.

يتألف الوسط المغذي بشكل عام من:

- المحلول المعدني الحاوي العناصر الكبرى والصغرى مثل المحلول المعدني لموراشيج وسكوغ (MS).

- الفيتامينات مثل التيامين والميواينوزيتول والبيوتين...

- أحماض أمينية الغلوتامين والتربتوفان ....

- مصدر للطاقة مثل السكروز أو الغلوكوز ...

- الهرمونات النباتية وخاصة السيتوكينين والأوكسين.

وهو يشابه تركيب الوسط المغذي الخاص بزرع البروتوبلاست ولكن الاختلاف بأن الوسط الخاص بزرع الخلايا لا يحوي على مواد حافظة للضغط الخلوي بسبب احتواء الخلايا على الجدار السيللوزي. يتم زرع الخلايا النباتية في وسط سائل ضمن معلق خلوي أو في وسط صلب في أطباق بتري. تتوجب معرفة نسبة حيوية الخلايا يمكن التحقق من حيويتها بعد العزل مباشرة بوساطة كاشف إيفان Evan's Blue))، ويتم ذلك بوضع 100 ميكروليتر من المعلق الخلوي في طبق بتري ويضاف له 10 ميكروليتر من صبغة إيفان بتركيز 0.4 مول يحضن المزيج لمدة 5 دقائق، يتم حساب النسبة المئوية للخلايا غير المصبوغة بأزرق ايفان وهي تعبر عن نسبة الخلايا الحية (1996 ,Bohmer & Meyer). كما يتم التحقق من درجة تركيز الخلايا بنفس الطرق المستخدمة في البروتوبلاست. يعد عدد خلايا الحرة الموجودة في المعلق باستخدام جهاز الهيماسيتوميتر Hemacytometer . (Bohmer &Meyer, 1996)

لا بد من الإشارة بأن خلايا المعلق الخلوي ليست ذات قدرة كافية على الانقسام والتطور وإعطاء نباتات كاملة، وتختلف النسبة بحسب الأنواع النباتية وحسب مصدر الخلايا الحرة، ففي تجربة نفذت على زراعة خلايا نبات الأسبرج، فقد لوحظ وجود ثلاث مجموعات من الخلايا الحرة:

- خلايا ميتة وتصل نسبتها بين 36-40%.

- خلايا حية ليس لها قدرة على الانقسام تبقى ساكنة في المعلق الخلوي.

- خلايا لها قدرة على الانقسام وتتطور وتشكل ميكروكالوس، تزداد نسبتها مع الزمن حتى تصل إلى 50% من خلايا المعلق الخلوي ( 1979 Jullien et Guern ).

مراحل تطور الخلايا الحرة في معلق خلوي:

يختلف منحنى النمو الخاص بالخلايا النباتية بحسب كثافة الخلايا بالمعلق الخلوي وبحسب النوع النباتي المستخدم، يقسم منحنى النمو إلى ثلاث أقسام:

- الطور التمهيدي: في هذا الطور الذي يستمر بالمتوسط 24 ساعة لا تدخل به الخلايا بمرحلة الانقسام تعمل الخلايا على القيام بعملية اصطناع المواد الضرورية للانقسام الخلوي في هذه المرحلة يلاحظ نشاط استقلابي كبير على مستوى الخلايا.

- الطور الانقسام الخلوي: ويلاحظ بدء نشاط كبير للخلايا بزيادة عددها بشكل ملحوظ، ويستدل على ذلك بزيادة دليل الانقسام الخلوي بشكل كبير Mitotic Index ويستمر طور الانقسام الخلوي عدة ايام حوالي 5 ايام تقريبا حيث يلاحظ في نهاية هذا الطور وصول عدد الخلايا في المعلق الخلوي إلى أقصى عدد ممكن. وغذا أردنا المحافظة على معدل إكثار خلوي مرتفع يتوجب تغيير الوسط المغذي بعد اسبوع على 10 ايام لتأمين حاجة الخلايا من العناصر المغذية.

- الطور التوقف عن الانقسام الخلوي: يلاحظ في هذا الطور توقف الخلايا النباتية عن الانقسام من خلال ثبات دليل الانقسام الخلوي. وتبدأ الخلايا في اصطناع بعض المركبات الثانوية التي تفيد في المحافظة على حياتها لفترة زمنية أطول، وتجعلها تقاوم عوامل الإجهادات اللاحيوية التي تتعرض لها في المعلق الخلوي. وخلال هذه المرحلة إذ لم يتم نقل الخلايا إلى وسط خلوي جديد ويزداد إفراز بعض المركبات في المعلق الخلوي التي تعمل على اسمرار الوسط وبدء موت الخلايا بشكل تدريجي. يستمر هذا الطور حوالي أسبوع تقريباً، لذلك يتوجب نقل الخلايا النباتية بمعدل مرة كل 15-20 يوم، للمحافظة على حيوية المعلق الخلوي.

تتطور الخلايا في معلق خلوي، ويمكن أن تعطي أجنة خضرية مباشرة دون المرور بمرحلة الكالوس، وفي هذه الحالة تعد طريقة من طرائق التكاثر الخضري الدقيق حيث تكون النباتات الناتجة مشابهة في أغلب الأحيان للنبات الأم.

كما يمكن أن تتطور الخلايا النباتية وتكون ميكروكالوس وهذا الميكروكالوس يتكاثر ويعطى إما كالوس جنيني أو كالوس عضوي وفي مرحلة لاحقة يتطور ويشكل نباتات وذلك حسب تقانة تكوين الأجنة غير المباشر أو تكوين نباتات كاملة بشكل غير مباشر ( Indirect Organogenesis ). وفي هذه الحالة تكون النباتات الناتجة مشابهة أو مغايرة في تركيبها الوراثي للنبات الأم. ويتم الحصول على مصدر للخلط الوراثي أو سلالات أو أصناف جديدة، لذلك تعد في هذه الحالة تقانة زرع الخلايا النباتية طريقة من طرائق التحسين الوراثي.

العوامل المؤثرة في زرع الخلايا النباتية:

تؤثر عوامل عديدة في قدرة الخلايا النباتية في التطور وتكوين نباتات كاملة تقسم العوامل إلى عدة أقسام:

- عوامل متعلقة بتركيب الأوساط الغذائية: مثل المحلول المعدني، تركيز الهرمونات النباتية ونوعها، طبيعة الوسط المغذي سائل أو صلب....

فقد لوحظ في حال نمو الخلوي في وسط سائل، أعطى كتلة حيوية بشكل أكبر من الوسط الصلب (2008 ,.Ngara et al). كما لوحظ لنوع الهرمونات النباتية وتركيزها تأثير واضح في نمو الخلايا النباتية. ففي تجربة على الشوندر السكري فقد تم الحصول على أكبر كتلة حيوية وقدرة على انقسام الخلايا في وسط سائل يحوي 0.25 مع/ل من ال BAP و 0.25 مع /ل من الـ D2,4 ( 2002 ,.Gurel et al ).

- عوامل متعلقة بالنوع النباتي وبمصدر الخلايا النباتية تختلف قدرة الخلايا النباتية على النمو والتطور باختلاف الأنواع النباتية في بعض الأنواع يلاحظ نمو سريع للخلايا النباتية مثل التبغ، وفي بعض الأنواع يلاحظ نمو بطيء للخلايا في المعلق الخلوي. كما لمصدر الخلايا النباتية تأثير واضح في قدرتها على النمو وتكوين نباتات كاملة، فقد لوحظ في نبات الجبربيرا بأن الخلايا المعزولة من كالوس لها قدرة على النمو بشكل أكبر من خلايا معزولة من الأوراق (2008 ,.Ngara et al).

- عوامل تتعلق بشروط زرع الخلايا الحرة: مثل عدد الخلايا الحرة في 1مل من المعلق الخلوي ففي حال خلايا التبغ فقد لوحظ بأن أفضل كثافة للخلايا حوالي 200000 خلية بالجربيرا 30000 خلية بمل ( Chaussat and Bigot, 1982; Ngara et al., 2008 ).

تطبيقات زراعة الخلايا النباتية:

تستخدم تقانة زراعة الخلايا النباتية في المجالات التالية:

1- في مجال الإكثار الخضري: عند تطور الخلايا النباتية بشكل مباشر من دون المرور بمرحلة الكالوس فيمكن الحصول على تطور مباشر للأجنة الخضرية أو تطور مباشر للبراعم وبالتالي الحصول على نباتات كاملة. ففي هذه الحالة تكون النباتات الناتجة مشابهة للنبات الأم. لا تستخدم تقانة زرع الخلايا النباتية للإكثار الخضري، لأنه من الصعب التمييز في مرحلة مبكرة بين الخلايا التي تطورت مباشرة من الخلايا التي تطورت بشكل غير مباشر، وهذا يعني بوجود شك من ناحية التشابه الوراثي مع النبات الأم.

2- في مجال التحسين الوراثي: تعد طريقة زراعة الخلايا النباتية من طرائق الحصول على سلالات متباينة وراثيا. عند تكون نباتات كاملة بعد تكوين الكالوس من الخلايا الحرة، أي تكوين أجنة خضرية أو براعم بشكل غير مباشر. وقد تحمل السلالات الجديدة صفة جديدة مثل المقاومة لبعض الأمراض أو صفة مميزة مهمة في برنامج التحسين الوراثي للنبات المدروس.

تجديد النباتات بدءاً من زراعة الخلايا النباتية: تختلف الشروط المثلى لتجديد النباتات من نوع نباتي إلى نوع نباتي آخر، لذلك ليتم الحصول على التجديد لنبات ما لابد من وضع شروط الوسط المناسب والشروط الفيزيولوجية والبيئية المناسبة.

مثال: فقد تم الحصول على نباتات كاملة في الشوندر السكري بدءاً من زرع الخلايا النباتية وفق الآتي 2002,Gures et al: تم الحصول على معلق خلوي بدءاً من الكالوس.

زرعت الخلايا الحرة في وسط يحوي MS+0.25mg/l BAP +0.25mg/2.4.D لمدة 15 يوما بالظلام لتكوين الكالوس. نقل الكالوس إلى وسط مغذ صلب يحوي 0.3 + MS mg/l BAP+0.1 mg/l IAA بهدف إكثار الكالوس، وكررت عملية النقل إلى الوسط نفسه عدة مرات بهدف الحصول على كميات كافية من الكالوس تكفي لتجارب التجديد فيما بعد.

نقل الكالوس إلى وسط تجديد يحوي MS + 1mg/I BAP+0.3mg/l IAA. عرض الكالوس إلى درجة حرارة منخفضة 4 م لمدة 15 يوماً بالظلام قبل النقل إلى وسط التجديد، وأعطى الكالوس بعد شهر من الزراعة بالإضاءة على براعم نقلت البراعم إلى وسط تجذير وأعطت جذوراً، وتم الحصول على نباتات كاملة.

ففي قصب السكر تم الحصول على طفرات متحملة لبعض الأمراض بوساطة زراعة الخلايا النباتية.

3- الحصول على طفرات عالية الإنتاج من الأحماض الأمينية:

تسمح تقانة زرع الخلايا النباتية في بعض النباتات مثل الحبوب بإنتاج بعض الطفرات او السلالات عالية الإنتاج من بعض الأحماض الأمينية مثل التربتوفان اللايسين والميثيونين.

عند إضافة بعض مشابهات الأحماض الأمينية إلى وسط المغذي الخاص بالمعلق الخلوي. تمتص خلايا المعلق المشابهات المضافة مما يؤدي إلى تثبيط تكوين الحمض الأميني المذكور، مما يعمل على إحداث خلل كبير في نمو الخلايا. لا بل توقف كامل لنموها بسبب نقص في الحمض الاميني. وتبدأ الخلايا بالتماوت.

تعمل بعض خلايا في المعلق الخلوي على تطوير أسلوب للتأقلم مع الوسط الجديد، بحيث تستطيع بشكل خفيف على اصطناع الحمض الأميني على الرغم من وجود المشابه في الوسط عن طريق تطوير نظام أنزيمي الخاص بإنتاج الحمض الأميني المدروس. وتستطيع ان تبقى على قيد الحياة. عند نقل الخلايا إلى وسط جديد بدون إضافة المشابه تستطيع إنتاج كمية أعلى من الحمض الأميني المذكور وتسمى في هذه الحالة خلايا عالية الإنتاج من الحمض الأميني المدروس ( Superprodectrices ).

مثال: إنتاج التربتوفان في معلق خلايا التبغ:

أضيف مركب 5.D.L.Methyltryptophane. إلى معلق خلوي لنبات التبغ، هذا المركب مشابه للتربتوفان أدى إلى توقف وتثبيط تكون التربتوفان في المعلق الخلوي وذلك عن طريق تثبيط النظام الأنزيمي الخاص بإنتاج التربتوفان Antranilax synthetaser كما هو موضح بالشكل ( 1 ):

Antranilate synthetase → Glutamine + Acid chorismique

Thryptophane →  Acid Anthranitique →

الشكل (1) : إنتاج التربتوفان في المعلق الخلوي

عند زرع الخلايا مع المشابه لم يلاحظ أي مظهر لنمو الخلايا وانقسامها وقسم كبير من الخلايا تماوت بسبب عدم تمكنها من إنتاج التربتوفان.

استطاعت بعض خلايا من النمو الخفيف بعد 30-60 يوما من بداية التجربة. حيث طورت نفسها واستطاعت من تطوير النظام الأنزيمي وإنتاج التربتوفان بكمية خفيفة على الرغم من وجود المشابه في الوسط.

نقلت هذه الخلايا إلى وسط جديد خالي من المشابه، استطاعت إنتاج تركيز عال من التربتوفان بالمقارنة مع الخلايا العادية واستطاعت إنتاج أضعاف النسبة المنتجة في الخلايا العادية.

4- إنتاج المواد الفعالة بوساطة زرع الخلايا النباتية:

تستطيع الخلايا النباتية من إنتاج مجموعة كبيرة من المركبات الثانوية الفعالة التي لها أهمية كبيرة في الصناعات الدوائية والعطرية والتجميلية مثل القلويدات والستروئيدات والصبغات والمضادات الحيوية قبل التكلم عن كيفية إنتاجها بالخلايا النباتية لا بد من التعرف على هذه المركبات الفعالة بشيء من التفصيل.

المنتجات الاستقلابية في النبات وفي الخلايا النباتية:

ينتج النبات اثناء حياته مجموعة كبيرة من المركبات الكيميائية والتي يحتاجها لنموه وحمايته من المؤثرات الخارجية. تقسم هذه المركبات إلى قسمين:

المنتجات الأولية مثل الكربوهيدرات - البروتينات - الدسم - الأحماض النووية والهرمونات النباتية. ويتم إنتاجها من قبل النبات بتراكيز مختلفة وهي ضرورية لنمو النبات وتطوره وإكمال حياته.

المنتجات الثانوية: مركبات ثانوية ينتجها النبات لتأمين احتياجاته الضرورية لمقاومة الإجهادات الحيوية واللاحيوية وتنتج هذه المركبات من استقلاب المركبات الأولية. تقسم المنتجات الثانوية إلى:

- منتجات ثانوية تستخدم لحماية النباتات من الأحياء الممرضة مثل البكتريا والحشرات والفيروسات والنيماتودا والفطور.

- منتجات جاذبة للحشرات لإتمام عملية التلقيح وإنتاج البذور.

- منتجات مهمة لزيادة تحمل النبات للإجهادات اللاحيوية.

- منتجات ثانوية لأغراض إنتاج الأدوية والمستخدمة في معالجة أمراض الإنسان والحيوان.

- منتجات ثانوية تستخدم في الصناعات الغذائية والتحويلية.

يوجد أكثر من 250000 مركب ثانوي يتم اصطناعها في الخلايا والأنسجة النباتية وتقسم إلى أربع مجموعات مهمة وهي:

القلويدات ALKaloids

الغليكوسيدات Glycosides

الفينولات Phenolic compounds

التربينوئيدات Terpenoids

Damascul

1- القلويدات ALKaloids:

تتكون مركبات هذه العائلة من الأحماض الأمينية مثل التيروزين - التربتوفان - الآرجنين - الأورثينين - واللايسين. تحتوي أغلب مركبات هذه العائلة على قلويدات اندولية حلقية تنحدر من التربتوفان.

تستخدم المنتجات الثانوية لهذه المجموعة بشكل رئيس في صناعة الأدوية. وأمثلة على هذه المجموعة نذكر على سبيل الذكر لا الحصر:

التروبان Tropane، الأتروبين Atropine، المورفين morphine، الكودئين Cocaine ، الكوكائين Cocaine، الهيوسيامين Hyoscymine، السكوبولامين Scopolamine ، البربرين Berberine

2- التربينوئيدات Terpenoides: تتألف مركبات هذه العائلة من 5 ذرات كربون ومضاعفاتها تدعى الوحدة الخماسية بالأيزوبيرين Isoperine . ويمثل الجدول (1) تصنيف التربينوئيدات مع عدد ذرات الكربون.

جدول (1) تصنيف التربينوئيدات

مثال الـ Farnesol: يستخدم مادة عطرية، ومبيداً، حشرياً، ومضاداً سرطانياً ومضاداً بكترياً.

مثال 2 Taxol: يستخدم كمضاد سرطان وخاصة لسرطان الثدي.

3- المجموعة الثالثة المركبات الفينولية: تنحدر من مركب الفينول، وتتكون من الأحماض الأمينية العطرية مثل التيروزين والفينيل آلانين.

تلعب المركبات الفينولية دوراً مهماً في حماية الخلايا كمضادات أكسدة ومنع تكوين وتطور الخلايا السرطانية من خلال تنظيم انتقال الأوكسينات والأنزيمات التي تعيق من تطور وتكوين الدرينات السرطانية في النبات ( 2016 ,.Rasouli et al ).

تعد المركبات الفينولية من أوسع المركبات الثانوية التي ينتجها النبات ذات الوزن الجزيئي المنخفض. ويوجد أكثر من 8000 مركب يتبع هذه المجموعة (2014,.Sedighi et al). تؤثر هذه المركبات في كثير من الحقول في الغذاء والكيمياء والطب والصيدلة. ولها تأثيرات بيولوجية مختلفة كمضادات أكسدة، ومضادة للبكتريا وللفطور، وتلعب دورا في حفظ الأغذية والمحافظة على صحة الإنسان كمركبات وقائية تجنب الإنسان الكثير من الأمراض وتزيد من مناعة الجسم.

يزداد إنتاج المركبات الفينولية عند تعرض الخلايا والأنسجة النباتية إلى عوامل الإجهاد المختلفة مثل الحرارة والضوء وعوامل الوسط المغذي والجفاف والملوحة .... الخ.

تضم المركبات الفينولية الكثير من المركبات مثل المركبات الأنتوسيانية والمركبات الفلافونية (Flavones, Flavonols) Flavonoids.

الكومارين واللغنين ...

4- المجموعة الرابعة الغليكوزيدات Glycosides، تحوي هذه المجموعة على الكربوهيدرات المرتبطة مع مركبات غير كربونية. ويوجد في النبات مجموعة كبيرة من الغليكوزيدات وذات الفائدة الطبية والصناعية.

مثل بعض المواد السامة التي توجد في الأنسجة النباتية المختلفة كالأميغدالين Amygdalin التي توجد في بذور اللوز المر وهي غليكوسيد مرتبط مع المركبات السيانيدية (Cyanogenic glycosides).

الريزين Resine مادة سامة تحوي زيوت طيارة اللاتكس Latex السائل الحليبي يتكون من بروتينات وقلويدات وسكريات ونشا ودهون .. تانينات...

المطاط الطبيعي

الفيتوستيرول Phytosteroles: مركبات تحوي زيوت نباتية توجد بشكل حر في الخلايا أو على شكل غليكوزيدات مع الدهون.

5- أمثلة على بعض المواد الفعالة:

- المركبات الثانوية المستخدمة لعلاج القلب مثل الديجوكسين Digoxin، اللانوكسين Lanoxin.

- المركبات الثانوية المستخدمة في علاج السرطان، ويتم إنتاجها من النباتات مثل:

Viniblastine, Vinicristine, Ellipticine, Taxol, Quercetine, baccharin , Podophyllotoxin, Brucentine,

المركبات المستخدمة كمضاد حشرات مثل Rotenoids, Pyrethrins, neem, . Nicotine

- المركبات المستخدمة في الطعم مثل الفانيليا ، الفلفل ، الكوكا ، الكمون Cardamon

- المركبات المستخدمة كملونات طبيعية مثل الزعفران ،Anthocyni Saffron الكاروتينات، الكلوروفيل، الريبوفلافين، الكوركومين Curcumine

- إنتاج المواد الفعالة بزرع الخلايا النباتية:

يعد إنتاج المواد الفعالة الطبيعية بوساطة زرع الخلايا النباتية من أهم تطبيقات زراعة الخلايا النباتية، توجد أبحاث كثيرة في هذا المجال ولكن الأعمال التي وصلت إلى الإنتاج التجاري قليلة جداً، ويعزى ذلك للأسباب الآتية:

- يوجد فروقات كبيرة في إنتاج المواد الفعالة بحسب التركيب الوراثي للنباتات الطبية واختلاف في قدرة الخلايا في إنتاج المواد الفعالة وذلك حسب السلالات الخلوية.

- عدم وجود استمرارية لفترة زمنية طويلة في قدرة الخلايا على إنتاج المواد الفعالة ويعزى ذلك لتغير في التركيب الوراثي للسلالات المنتخبة والذي ينعكس سلباً بتغير في النظام الأنزيمي في الخلايا الذي يمكن ان ينعكس سلبا في كمية المادة الفعالة المنتجة.

- إن نقل نتائج الأبحاث من المخبر إلى المصانع ليس بالأمر السهل يمكن أن يؤثر بشكل كبير في تعرض الخلايا النباتية إلى بعض التغيرات في الوسط أو في شروط الإنتاج والتي تسبب في تغير في مستوى الإنتاج وفي استمراريته.

العوامل المؤثرة في إنتاج المواد الفعالة بزراعة الخلايا النباتية:

1- انتخاب سلالات من الخلايا ذات إنتاجية عالية من المادة الفعالة:

في بداية الأمر يتوجب تحديد النباتات البرية ذات الإنتاجية العالية ليصار إلى استخدامها في برنامج الانتخاب الخلوي.

انتخاب أي الأجزاء النباتية من هذه النباتات تعطي سلالات خلوية مميزة الإنتاج هل الأوراق أو البراعم أم الجذور .... ليكون مصدر جيد للكالوس حتى يتم الحصول على معلق خلوي مناسب.

انتخاب السلالات الخلوية ذات الإنتاجية العالية من المواد الفعالة وهنا لابد من الذكر بانه يمكن انتخاب سلالات خلوية عالية الإنتاج من المواد الفعالة Superprodoctrices عن طريق إضافة المشابهات Analogues إلى الوسط المغذي وانتخاب السلالات التي تبدي مقاومة للمشابه.

2- دراسة تركيب البيئة المناسبة والظروف البيئية: بهدف الحصول على أكبر كمية من المادة الفعالة وهذا يتطلب دراسة تأثير تركيب الأوساط المغذية من المواد المعدنية والسكروز والمواد الأزوتية والـ pH والهرمونات النباتية. كما يتطلب دراسة شروط غرف النمو الحرارة والإضاءة ونسبة الرطوبة. ويختلف تركيب الأوساط المغذية وشروط غرف النمو من نوع نباتي إلى نوع نباتي آخر. ولذلك لابد من دراسة كافة العوامل حتى يتم الحصول على أعلى كمية ممكنة من المواد الفعالة.

مثال إنتاج مادة الهيبرسين:

تعد مادة الهيبرسين Hypericin مادة فعالة تدخل في صناعة الأدوية النفسية والعصبية. أنتجت هذه المادة بوساطة زراعة خلايا من نبات Hypericum perforatum. اخذت أوراق النبات المذكور وزرعت في وسط يحوي MS+K+ 24D لتكوين الكالوس بهدف الحصول فيما بعد على معلق خلوي زرعت الخلايا في وسط مناسب لإنتاج مادة الهيبرسين كما هو موضح بالشكل (2):

الشكل (2) إنتاج الهيبرسين Hypericin في معلق خلوي لنبات الـ Hypericum بوجود محرض

لوحظ إنتاج أكبر كمية من المادة الفعالة في الظلام بدءاً من خلايا أخذت من الكالوس المتكون من الأوراق بالمقارنة مع نسبة المادة الفعالة المنتجة من خلايا كالوس متكون من الجذور والقمم النامية (2002 ,.Bais et al).

ويوضح الشكل (3) إنتاج مادة الديجوكسين من زرع خلايا نبات الديجيتاليس في المخبر، إذ يتم استخلاص المادة الفعالة من الوسط المغذي أو من الخلايا نفسها أو من الاثنين معاً.

3- إضافة مواد محرضة Elicitors لإنتاج المواد الفعالة:

عند تعرض النبات للإجهادات الحيوية واللاحيوية ينتج النبات بعض المواد للدفاع عن نفسه مثل حمض السالسيليك وميتيل، جاسمونات، وقد لوحظ عند إضافة هذه المواد المحرضة إلى وسط المعلق الخلوي أدى إلى زيادة إنتاج المواد الفعالة. يجب أمثلة التركيز الأنسب ونوع المادة المحرضة وعمر الخلايا النباتية وموعد إضافة المادة المحرضة كل هذه العوامل تؤثر في زيادة إنتاج المادة الفعالة فقد تم الحصول على زيادة واضحة في نسبة المادة الفعالة باكليتاكسل Paclitaxel مضادة سرطان عند إضافة المحرض ميتيل جاسمونات إلى معلق خلوي من نبات Taxus medica وذلك بعد 8 أيام من عمر المعلق الخلوي بالمقارنة مع إضافة المادة المحرضة بعد 14 يوماً (1999 ,.Ketchum et al).

كما يمكن إضافة أكثر من محرض لزيادة إنتاج المادة الفعالة، فقد تم الحصول على زيادة واضحة في إنتاج مادة التاكسانPalitaxel ) Taxsane  ) عند إضافة ميتيل جاسمونات مع مادة محرضة ثانية وهي سيكلوديكسترين Cyclodextrine إلى معلق خلوي من نبات Sabater-Jara et al., 2014 ) Taxus medica).

مثال على تأثير المادة المحرضة في إنتاج المواد الفعالة:

يتم إنتاج مادة الويذافيرين Withaferin A من معلق خلوي من نبات Withania somnifera وهو نبات طبي شجيري مستديم الخضرة يعيش بشكل أساسي في الهند والباكستان، لوحظ عند إضافة مادة محرضة إلى المعلق الخلوي مثل السالاسين Salacin أنه أدى إلى زيادة واضحة في نسبة المادة الفعالة المنتجة بلغ معدل الزيادة 50 ضعف بعد 15 يوما من إضافة المادة المحرضة. وكان أفضل تركيز من السالاسين 750 ميليمول حيث بلغ إنتاجWithaferin A  25 مغ/ل بينما في حال الشاهد كان معدل الإنتاج 0.47 مع/ل (Ciddi, 2006).

4- التحول الحيوي Biotransformation: وتتم إضافة طليعة المادة الفعالة إلى الوسط المغذي وتعمل الخلايا النباتية بتحويلها إلى المادة الفعالة بوساطة النظام الأنزيمي المتوفر داخل خلايا المعلق الخلوي تشكل مادة الأرتيميزين Artemisinin طليعة المادة الفعالة لمركب دي أوكسي أرتيميزين Deoxyartemisinin. فعند إضافة الأرتيميزين إلى معلق خلوي لنبات ال Catharantus roseus يتم التحول بنسبة 78% ( ,.Patel et al2010 ).

تؤثر بعض العوامل بالاصطناع الحيوي مثل النوع النباتي، نوعية المادة المضافة وكميتها، الوسط المغذي وطبيعته ونسبة الهرمونات النباتية المضافة الفترة الزمنية التي تضاف فيها طليعة المادة الفعالة ففي حال المعلق الخلوي Catharantus roseus عند إضافة الأرتيميزين مباشرة منذ بداية الزرع فلا يلاحظ أي تحول حيوي، بينما عند إضافة طليعة المادة الفعالة بعد 20 يوم من الزرع فيلاحظ نسبة عالية من التحول الحيوي تصل إلى 78 %.

5- إضافة بعض المواد لزيادة النفاذية الخلوية:

تعمل إضافة بعض المواد إلى المعلق الخلوي إلى زيادة نفاذية المواد الفعالة من الفجوات الخلوية وعبر الأغشية الخلوية إلى الوسط المغذي. لا تؤثر المواد المضافة على حيوية الخلايا كما لا تؤثر في نسبة اصطناع المواد الفعالة في المعلق الخلوي.

تستخدم عدة مواد عضوية مثل الإيزوبروبانول Isopropanol دي ميتيل سلفوكسيد DMSO والشيتوزان .Chitosan. يلعب موعد إضافتها وتركيزها دوراً مهماً في زيادة النفاذية الخلوية وفي قدرة الخلايا على إنتاج المادة الفعالة.

مثال أضيف مادة الديكانول Decanol إلى معلق خلوي من نبات الـ Taxux chinensis، ادى إلى زيادة إنتاج مادة Paclitaxel عن طريق زيادة نفاذية الأغشية الخلوية مما يؤدي إلى زيادة تركيز المادة الفعالة في الوسط المغذي مما يسهل من استخلاصها من الوسط (Wang et al., 2001).

6- استخدام خلايا الكامبيوم في إنتاج المواد الفعالة:

تمتاز خلايا الكامبيوم بمزايا متعددة تجعل لها أهمية خاصة في إنتاج المواد الفعالة ومن هذه المزايا:

1- تتصف بقدرتها على الانقسام اللامتناهي مما يؤدي إلى تكوين كتلة كبيرة من المادة الحية.

2- تعمل على إنتاج المواد الفعالة بتراكيز عالية.

3- تنتج المواد الفعالة لفترة طويلة نسبياً مما يعطي استمرارية في إنتاج المواد الفعالة لفترة أطول.

4- تتصف أغشيتها الخلوية برقتها مما يزيد في نفاذيتها الخلوية، وهذا يسهل من انتقال المواد الفعالة من الفجوات إلى الوسط بشكل أسهل وأسرع.

5- تستجيب لإضافة المواد المحرضة بشكل كبير مما يزيد من إنتاج المواد الفعالة.

لذلك لوحظ استخدام هذا المصدر من الخلايا النباتية لإنتاج بعض المواد الفعالة التي يمكن أن تؤدي إلى استخدامها فيما بعد على النطاق التجاري ( 2010,Lee et al ).

وتجدر الإشارة بأن يمكن إنتاج بعض المواد بوساطة زراعة الخلايا النباتية، وهي غير موجودة أصلاً في النبات الأم، فقد تمكن فريق ياباني من إنتاج خمس مواد فعالة مضادة للبكتريا في معلق خلوي من نبات Tectonia grandiss مع العلم بأن هذه المواد المنتجة غير موجودة في النبات الكامل بالطبيعة (1998 ,.Kawazzu et al ). زرعت أوراق النبات المذكور بعد تعقيمها في وسط مغذ لتكوين الكالوس ثم اخذت الخلايا من الكالوس بهدف إنتاج المواد الفعالة.

وبالختام لابد من القول بأن هذه التقانة لها أهمية كبيرة في إنتاج المواد الفعالة ذات المصدر الطبيعي، وهي تقانة واعدة وخاصة بأنه على المستوى المخبري توجد أبحاث بالآلاف التي تمكن فيها العلماء بإنتاج أعداد كبيرة من المواد الفعالة، التي لها أهمية كبيرة في مجال مجال الطب والصيدلة والصناعات الغذائية والتجميلية والدوائية، ولكن لا يزال عدد محدود من الأبحاث التي طبقت في الإنتاج التجاري بشكل كامل وهنا تكمن المشكلة وهي بنقل النتائج المخبرية من المستوى الصغير إلى المستوى الصناعي فهذا يحتاج إلى أمثلة تقانة الانتاج ودراسة بالتفصيل العوامل المؤثرة في الانتاج على المستوى الصناعي. والمشكلة الثانية عدم استمرارية انتاج المواد الفعالة لفترة زمنية طويلة بسبب عوامل فيزيولوجية ووراثية تؤثر في انتاج المواد الفعالة في الخلايا النباتية. كما لابد من تطوير مفاعلات حيوية كبيرة يتم السيطرة فيها على عوامل الوسط وشروط الانتاج بدقة حتى يتم تامين استمرارية الانتاج لفترة زمنية طويلة.