البيئة الغذائية لزراعة الأنسجة النباتية

مكونات البيئة المغذية اللازمة للزراعة النسيجية

تختلف البيئات المستخدمة لزراعة الأنسجة والخلايا النباتية اختلافا كبيرا كما أن إضافة بعض المواد المعينة لبيئة الزراعة قد يكون له تأثير في الحصول على نتائج محددة وعلى العموم، فإنه يجب أن تحتوي كل بيئة على مغذيات كبري ومغذيات صغرى وهذه المغذيات توجد في صورة أملاح لبعض المعادن كما يضاف السكروز والأجار إلى البيئة وأيضا مستخلص الخميرة أو لبن جوز الهند الذى قد يساعد على استمرار فترة نمو الأنسجة كما يختلف تركيب البيئة حسب نوع وصنف النبات المستخدم ويعد الوسط الغذائي ومكوناته واحداً من أهم العوامل التي تؤثر في الجزء النباتي المزروع explant وعلى طبيعة نموه وانقسام خلاياه ومدى تخصصه إلى أعضاء متكونة، فنجد أن العديد من البيئات التي تستخدم في زراعة الأنسجة والخلايا تعتمد على عدد من التراكيب التي أعطت نتائج مميزة والتي تم التوصل إليها بواسطة عدد من الباحثين من أهمها بيئة موراشيجي وهويت وجامبورج.

White, 1943 and 1963, Murashige and Skoog, 1962, Gamborg et al, 1968,and Huang and Murashige, 1976

تتكون البيئة المغذية من الآتي:

أولا: المواد المعدنية وتشمل:

۱- العناصر الضرورية الكبرى وتشمل:

النيتروجين، الفوسفور، البوتاسيوم، الكالسيوم، الماغنسيوم و الكبريت.

٢- العناصر الضرورية الصغرى وتشمل:

الحديد، الزنك، المنجنيز، البورون، الملبدينم، الكلور، النحاس والكوبالت.

ثانياً: المواد العضوية وتشمل:

1- السكر: سكروز، جلوكوز وفراكتوز.

2- فيتامينات: فيتامين بيرودكسين وحمض نيكوتينيلك.

3- الأحماض الأمينية والأميدات: جلايسين، تيروزين وجلوتامين.

4- مواد عضوية أخرى:

أ- اينوزيتول.

ب- البيورينات، البريميدينات.

ج- أحماض عضوية: حمض الأسكوربيك وحمض السيتريك.

د- مركبات فينولية: فلورجليسينول.

هـ- المركبات الطبيعية معقدة التركيب:

1- مستخلص الخميرة.

2- لبن جوز الهند.

3- مستخلص المولت.

4- كأزين هيدروليزيت.

و- منظمات النمو النباتية:

1- الأوكسين: إندول حمض الخليك، إندول حمض البيوتريك، نفثالين حمض الخليك، 5 ، 4 ، 2 ، داي كلوروفينوكسي حمض الحليك.

2- السيتوكاينين: الكيتين، بنزايل أدينين، الزياتين وإيزوبنتينايل أدينين.

ثالثا: مواد داعمة للبيئة:

أهمها الأجار وهو عبارة عن سكريات عديدة مستخلصة من الطحالب الحمراء Gelidium corneum. بينما الفيتاجيل أو الجيل رايت وهي أسماء تجارية لمنتج من بكتيريا .Pseudomonas sp وتنمو البكتيريا في مخمرات بالمعمل وتمتاز هذه المادة الشبيهة بالأجار بثبات المكونات وعدم احتوائها على شوائب مما يجعلها أكثر شفافية من الأجار العادي وذلك يساعد على سهولة الكشف عن أي ملوثات تظهر في البيئة وأيضا تستخدم بكمية أقل من الأجار في تحضير البيئات. ومن خواصه يمكن خلطه بالماء الساخن أو البارد ويكون جل شفاف متماسك في وجود عديد من الأملاح الذائبة في المحلول وله القدرة ونباتات زراعة الأنسجة.

أولاً: المواد المعدنية:

۱- العناصر الضرورية الكبرى و تشمل:

النيتروجين والفسفور والبوتاسيوم والكالسيوم والماغنسيوم والكبريت، ومصادر الأملاح الآتية: حسب بيئة موراشيجي وسكوج عام ١٩٦٢:

1. نترات الامونيوم NH4NO3
2. نترات البوتاسيوم KNO3
3. كلوريد الكالسيوم Ca Cl₂ 2H₂O
4. بوتاسيوم داي هيدروجين أورثوفوسفات KH₂PO₄
5. كبريتات الماغنسيوم MgSO₄.7H₂O

ويجب الأخذ في الاعتبار جزيئات الماء الموجودة في الملح، وبدراسة مبسطة لهذه الأملاح نجد أنها مصدر للعناصر الضرورية الكبرى حيث انها عناصر تركيبية تداخل في تركيب مكونات الخلية النباتية في مزارع الأنسجة النباتية، فنجد أن:

1) النيتروجين: يدخل في تركيب الأحماض الأمينية والبروتين والكلوروفيل والأحماض النووية (الحامض النووي داي أوكسى رايبونيوكليك أسيد) (DNA) والحامض النووي الرايبوزي (RNA) وكذلك يدخل في تركيب الإنزيمات والتي تعتبر عاملاً مساعداً حيوياً يسرع من التفاعلات البيولوجية بالخلية النباتية، ونجد كذلك النيتروجين في كثير من الهورمونات النباتية مثل الأوكسينات التي تحتوي على حلقة الإندول مثل إندول حمض الخليك، وكذلك في تركيب مركبات السيتوكينين مثل الكاينتين والبنزايل آدنين وهذه المركبات الهرمونية تساعد علي نمو النباتات وتكوين الجذور بالنسبة للأوكسين وتكون الأفرع والتضاعف والزيادة العددية بالنسبة للسيتوكاينين.

٢) الفوسفور: يدخل في تكوين الفوسفوليبيد – الأحماض النووية

مثل (DNA , RNA) السكريات (جلوكوز - فوسفات) وكذلك مركبات الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وكذلك AMP ،ADP لإمداد الخلية بالطاقة.

3) الماغنسيوم: يدخل في تركيب الكلوروفيل وبالتالي يعمل على زيادة اللون الأخضر في النباتات وعند غيابه تصفر النباتات ولا يستطيع النبات تكملة دورة حياته عند غيابه كلية.

4) الكالسيوم: من العناصر الضرورية للنبات وعند غيابه لا تتكون الصفيحة الوسطية المحتوية على بكتات الكالسيوم وبالتالي يعمل ذلك على اصفرار النبات وخاصة القمة النامية "shoot tip necrosis" وكذلك يؤدي نقصه الى ظهور الظاهرة الزجاجية "vitrification". وعند غياب العنصر كلية في البيئة لا يستطيع النبات تكملة دورة حياته.

ه) البوتاسيوم: من العناصر الضرورية للنبات حيث يساعد على امتصاص الماء وانتقال السكريات ولكن لم يعرف حتى الآن المركبات التي يدخل في تركيبها البوتاسيوم وعند غيابه كلية لا يستطيع النبات تكملة دورة حياته.

6) الكبريت: من العناصر الضرورية للنبات حيث يدخل في تركيب الأحماض الأمينية ستين، وستاين، وميثونين والببتيد جللوتاثيوم - حيث يساعد على إتمام تفاعلات الأكسدة والاختزال، وبغيابه كلية لا يستطيع النبات تكملة دورة حياته.

٢- العناصر الضرورية الصغرى:

وهذه العناصر ضرورية لحياة النبات وغيابها يعوق نمو الأنسجة، ولكن يحتاجها النبات بكميات قليلة، وتشمل: الحديد، والبورون، المنجنيز والزنك والنحاس، والكوبالت، والكلور، والموليبدنيم، واليود، ومصادرها الأملاح الآتية:

منظمات النمو المستخدمة في مزارع الأنسجة النباتية:

منظمات النمو growth regulators مركبات كيميائية يحتاجها النبات بكميات بسيطة جدا والغرض منها دفع خلايا النبات إلى التكشف والاستيلاد regeneration وقد يطلق عليها هرمونات نباتيه phyto-hormone أو منظمات النمو النباتية، واهمها السيتوكينينات والاوكسينات.

ليس هناك شك في أهمية منظمات النمو في مزارع الأنسجة النباتية. حيث تقدم العديد من الشركات التجارية مجموعة واسعة من منظمات نمو النبات تم اختبارها خصيصا لمزارع الخلايا النباتية. وتم فحص الصفات الطبيعية والكيميائية لكل منتج، ثم اختباره حيويا تبعا للمعايير الموضوعة للبيئة. وأيضا اختبار كل أوكسين من حيث تحفيز نمو الكالوس أو إنبات الجذور معملياً. تم اختبار كل سيتوكينين من ناحية تحفيز إنتاج النمو الخضري. وفي حالة الإنتاج على هيئه محلول يتم ترشيح محلول منظم النمو بواسطة مرشح مزدوج معقم ۰٫۲ ميكرومتر الي زجاجات معقمة. يتم اختبار تعقيم كل محلول منظم نباتي طبقا للمواصفات التي وضعتها الفارماكوبيا الأمريكية جزء 21، بالإضافة لاختبار حيوي يستخدم معايير مطابقة لتلك الموضوعة لبيئة مزارع الأنسجة النباتية.

الاعداد لمحلول مركز لمنظم النمو

لأعداد محلول مركز ۱ مجم/ مل: ضع ۱۰۰ مجم من مسحوق منظم نمو النبات في قارورة أو وعاء زجاجي سعة 100 مل. أضف 2-5 مل من المذيب لإذابة المسحوق. حالما يتم الذوبان، اكمل الكمية بماء مزدوج المعالجة (مقطر مرتين). قد يكون من الضروري تقليب المحلول أثناء إضافة الماء للحفاظ على المواد في المحلول. خزّن المحلول المركز طبقا لما بالجداول. أضفت 0.1 مل من المحلول المركز إلى لتر من البيئة للوصول إلى تركيز نهائي 1.0 مج/ لتر من منظم نمو النبات في بيئة الزراعة (انظر الجدول أدناه).

كمية المحلول المركز المطلوب أخذها = (التركيز المطلوب للهرمون × كمية البيئة الراد تخضيرها) / تركيز المحلول المركز.

منظمات النمو النباتية

التركيب والرمز الكيميائي لمنظمات النمو النباتية الهامة المستخدمة في مزارع الأنسجة النباتية في الشكل(۲).

Auxins

إندول حامض الخليك   Indole acetic acid (IAA)

اندول حامض البيوتيريك Indole buteric acid (IBA)

نفثالين حامض الخليك (Naphthalene acetic acid (NAA.

كل هذه المركبات تذوب في كحول الايثانول او هيدروكسيد البوتاسيوم آو الصوديوم ويفضل هيدروكسيد البوتاسيوم ويجب ملاحظة أن هذه الأوكسينات تتأثر تأثراً كبيراً بحموضة وكمية الأملاح بالبيئة.

Cytokinines

طبيعي مثل الزياتين والأيزوبنتينايل أدينين (Natural (ZEATIN-2IP

صناعي مثل الكينيتين و البنزيل آدينين Synthetic (KIN-BA)

الجبريلينات مثل حامض الجبريليك Gibberllins: GA3

مثبطات ومؤخرات النمو مثل حامض الابسيسيك Growth retardant: ABA

يلاحظ أن مجموعة السيتوكينين تذوب في حامض الهيدروكلوريك وكذلك يمكن إذابتها في الكحول آو هيدروكسيد البوتاسيوم ويفضل حمض الهيدروكلوريلك. الجبريلينات ومثبطات النمو مثل حامض الابسيسيك تذوب في هيدروكسيد البوتاسيوم آو الكحول (الايثانول).

وكثيرا ما تذكر التركيزات بالملليمول والميكرومول، وفي هذه الحالة يجب تحويلها الي ملليجرام وميكروجرام طبقا للقانون الاتي:

- التركيز بالميكروجرام = التركيز بالميكرومول X الوزن الجزيئي.

- التركيز بالملليجرام = التركيز بالملليمول × الوزن الجزيئي.

ويجب الاستعانة بالجداول لمعرفة الأوزان الجزيئية للمركبات وكذلك الأوزان الذرية للعناصر الداخلة في بيئات مزارع الانسجة النباتية.

الشكل(۲) منظمات النمو النباتية الهامة المستخدمة في مزارع الأنسجة النباتية

أولاً: الأوكسينات:

آوكسينات مزرعة الخلايا النباتية تستخدم عموما بتركيز 0.01 – 10.0 مجم/ لتر. عند استخدامها بالتركيز المناسب قد تنظم استطالة وانقسام الخلايا، انتفاخ الأنسجة، تكون الجذور العرضية، تثبط تكون النموات الخضرية العرضية والفرعية، تكون نمو أنسجة الكالوس وأيضا تحفيز تخليق الأجنة.

أ- إندول حامض الخليك (IAA):

يعمل على تجذير النباتات وهذا المركب يجب إضافته بواسطة المرشحات البكتيرية لأن تعقيمه بواسطة الاوتوكلاف تحت ضغط 1.2 كجم/ سم۲ ودرجة حرارة ۱۲۱م يؤدي إلى تكسيره وتقليل الاستفادة منه وكذلك يجب حفظه في زجاجة بنية اللون حيث إنه يتأثر بالضوء. إلا أن هناك رأياً مخالفاً وهو يرى بإضافته قبل التعقيم في الأوتوكلاف ويفسر ذلك بعدم التحلل الكامل له أثناء التعقيم أو ارتباطه بمكونات البيئة.

ويضافIAA للبيئة في حدود من 0.1– 10 ملليجرام / لتر، ويجب أن تحفظ البيئة المحتوية على هذا الهرمون في الإظلام التام حتى لا يتكسر وتقل الاستفادة منه، ولقد وجد حديثا أن الزراعة في بيئات محتوية على الأوكسين والموضوعة في الإضاءة قد تكسر الأوكسين بعد 14 يوما كذلك يتأثر إندول أسيتيك أسيد بالحموضة والأملاح ويلاحظ ان هذا الاوكسين لا يذوب في الماء ويجب اذابته اولا في كحول الايثانول او هيدروكسيد البوتاسيوم.

التحضير:

يوزن ۱۰۰ مللي جرام من اندول آسيتيك وتذاب في هيدروكسيد البوتاسيوم ۱ ع ثم يكمل الحجم الي ۱۰۰ سم³ بالماء المقطر.

ب – نفثالين حمض الخليك (NAA):

من المركبات الأوكسينية التي تستخدم بكثرة في مزارع الأنسجة النباتية لتكوين الكالوس أو تكوين المجموع الجذري في المرحلة النهائية، ويلاحظ أن الاتزان الداخلي للاوكسين والسيتوكينين هو المحدد في جميع حالات نمو النبات.

وهذا الهرمون يذوب في كحول الايثانول وكذلك هيدروكسيد البوتاسيوم ويحضر بإذابة ۱۰۰ مللي جرام من الهرمون في هيدروكسيد البوتاسيوم ۱ع ثم يكمل الحجم الي ۱۰۰ سم³ وفي هذه الحالة يكون ۱ سم³-1 مللي جرام.

جـ – إندول حمض البيوتريك (IBA):

من الاوكسينات الهامة التي تستخدم على نطاق واسع في مزارع الأنسجة النباتية بهدف تكوين الجموع الجذري وهذا الهرمون ثابت نسبيا بالمقارنة باندول آسيتيك حيث إنه يتحمل التعقيم ولا يتكسر بدرجة الحرارة أو الضوء ويذوب أيضاً في كحول الإيثانول وهيدروكسيد البوتاسيوم ويتم تحضيره كمأ سبق مع اندول آسيتيلك.

د- 2،4 ثنائي كلوروفينوكسي حمض الخليك (2,4-D):

هذا الهرمون يستخدم كمبيد حشائش ويستخدم حاليا للمساعدة في تكوين الكالوس بالاتزان مع السيتوكينين، وهذا الهرمون يذوب أيضاً في كحول الإيثانول وكذلك هيدروكسيد البوتاسيوم.

والجدول (1) المرفق يبين تركيب الأوكسينات المختلفة التي تدخل في بيئات مزارع الأنسجة النباتية والأوزان الجزيئية والمذيب وطرق الحفظ والتعقيم.

جدول رقم (1) تركيب الاوكسينات المختلفة

ثانياً. السيتوكاينين:

السيتوكينينات تستخدم عموما في مزرعة الخلايا النباتية بتركيز 0.1-10.0 مجم / لتر. عند استخدامها بالتركيز المناسب تعمل على الزيادة العددية أثناء إكثار النباتات والمساعدة على تنظيم انقسام الخلايا، تحفيز توالد النموات العرضية والفرعية، تنظيم التمايز، تثبيط تكون الجذور، تفعيل تخليق RNA، تحفيز عمل البروتينات والإنزيمات وتقسم السيتوكينينات الى:

أ) سيتوكاينين طبيعي: مثل:

1– الزياتين. 2- زياتين رايبوزايد. 3- آيزو بنتنايل آدينين "2ip".

ب) سيتوكاينين صناعي: مثل:

1- الكينتين kinetin  2- البنزايل أدينين "BA"

ورموز هذه المركبات وآوزانها الجزيئية وتركيبها البنائي مذكور في الجداول المرفقة.

و هذه المركبات عامة تذوب في حمض الهيدروكلوريك وتحضر بإذابة ۱۰۰ ملليجرام من السيتوكاينين في ۱ عياري من حامض الهيدروكلوريك (من 5-10 نقط) ثم يكمل الحجم الى 100 سم³. وعامة تستخدم هذه المركبات بتركيز من 0.01 - 10 ملليجرام / لتر وبالنسبة للايزوبنتيل آدينين يستخدم حتي تركيز 30 ملليجرام / لتر.

وعامة فإن هذه المركبات ثابتة وتحفظ في الثلاجة وتعمل على انقسام الخلايا وزيادة النموات الجانبية ويستخدم كذلك مع الأوكسين لتكوين الكالوس وذلك عند الاتزان بين الاوكسين والسيتوكاينين.

والجدول(٢) المرفق يبين تركيب السيتوكينينات المختلفة التي تدخل في بيئات مزارع الأنسجة النباتية والأوزان الجزيئية والمذيب وطرق الحفظ والتعقيم.

جدول رقم (2) تركيب السيتوكينينات المختلفة

قد تستخدم مركبات الفينايل يوريا بدلا من مركبات السيتوكاينين لتكوين النموات الجانبية حيث تثبط مركبات الدايفينايل يوريا انزيمات اكسدة السيتوكاينين Cytokinin oxidase وبالتالي نحافظ علي تركيز السيتوكاينين الداخلي بتركيز عال ولا تهدمه الإنزيمات فيقوم بدوره في عمليات التضاعف. والجدول(3) المرفق يبين تركيب منظمات النمو الأخرى التي قد تدخل في تكوين بيئات مزارع الأنسجة النباتية والأوزان الجزيئية والمذيب وطرق الحفظ والتعقيم.

جدول رقم (3) تركيب بعضي منظمات النمو الأخرى

ويتم تحضير البيئة المغذية كالاتي:

تؤخذ الأحجام الموضحة بالجدول وتوضع في كأس به حوالى 500 سم³ من الماء المقطر ثم يضاف اليها من ۲۰-۳۰ جرام من السكروز + ۱۰۰ مللي جرام آينوزيتول وتضاف كذلك الهرمونات المطلوب إضافتها حسب الأبحاث التي أجريت من قبل وكذلك على حسب نوع النبات ومرحلته ويضبط ال "pH" عند 5 – 5.2 في البيئة السائلة، وعند 5.6 – 5.8 في البيئة الصلبة التي يضاف إليها الأجار أو الجيلرايت ويلاحظ أنه أحيانا يضاف فحم للبيئة وفي هذه الحالة يجب ضبط "pH عند 6 ثم تطبخ البيئة وتصب في أنابيب 25 × 10 مم أو في ماجينتات وهي علب بلاستيك مصنوعة من مادة البولي بروبلين وأحيانا من مادة البولي كربونات لتتحمل ظروف التعقيم الحراري وأحيانا أخرى تستخدم أنواع من البرطمانات المصنوعة من الزجاج ثم تعقم البيئة في أجهزة الأوتوكلاف علي ضغط من 1.1 -1.5 كجم/ سم۲ و درجة حرارة 121 م لمدة 20 دقيقة ثم تبرد البيئات وتحضن لمدة 4 أيام لاكتشاف أي تلوث ميكروبي وتكون جاهزة للزراعة، ويجب تحضين البيئة في جو مظلم حتى لا تتكسر بعض مركبات البيئة مثل الإندول أسيتيك بالضوء وكذلك تضاف بعض المركبات مثل الجبريلين والإندول أسيتيك والثيامين بواسطة المرشحات البكتيرية نظراً لتكسرها تحت ظروف التعقيم. وقد لا تحضن البيئات وتستخدم بعد أن تبرد عند التأكد من كفاءة التعقيم.

الأس الهيدروجيني pH : هو اللوغاريتم السالب لتركيزات أيونات الهيدروجين في محلول البيئة ويتراوح من 5–5.2 في البيئات السائلة ومن 5.6 –5.8 في البيئات الصلبة ويضبط الـ pH بالمحلول المنظم "Buffer Solution" وهو ذلك المحلول الذى يقاوم التغير في الـ pH ويلاحظ الآتي:

الـ "pH" المنخفض عن 4.5 أو الأعلى من 7 يؤثر تأثيراً سيئاً على نمو النباتات.

فإذا انخفض الـ "pH" عن 4.5 يحدث الآتي:

1- يتأثر ثبات إندول حمض الخليك "IAA" والجبريلين والثيامين والبنتوثنيك.

2- سيولة الأجار.

3- ترسيب املاح الفوسفات والحديد.

4- تقل الاستفادة من أيونات الأمونيوم نظراً لقلة الامتصاص.

ويختلف ال "pH" قبل وبعد التعقيم حيث تنخفض فيه ال "pH" من 3-5 وحدة ويلاحظ أن الـ "pH" ينخفض أيضا أثناء نمو النباتات (1986 .Skirvin, et al)

الضغط الاسموزي:

هو مجموع الضغوط الأسموزية للأملاح والسكريات وجميع مكونات البيئة المغذية وبدون شك فإن السكر له تأثير عال نسبياً على الضغط الأسموزي. ويقدر الضغط الاسموزي بالبار (1 بار = 10 بسكال) ولقد قدر الضغط الاسموزي للبيئات (جدول 4) ووجد كالاتي:

جدول (4) يوضح البيئات الغذائية المختلفة وضغطها الأسموزي

فإذا كان الضغط الأسموزي أعلى من 3.1 فإن النمو يتأثر تأثراً شديداً. ويزيد الضغط الأسموزي بإضافة المانيتول للبيئة.

ونظرا لشيوع استخدام بينة موراشيج وسكوج Murashige and Skoog , 1962 سوف نذكر طريقة التحضير التفصيلية.

1- اعداد بيئة موراشيج وسكوج Murashige and Skoog (MS) من المحاليل المركزة

إعداد المحاليل المركزة:

تحتوى المحاليل المركزة على نسبة عالية من مكونات البيئة (عادة يكون تركيزها عشرة أضعاف التركيز الذي يستخدم في البيئة) والتي نأخذ كمية منها لمزجها مع مكونات أخرى للبيئة. تمزج الأملاح التي لا يؤدي كل منها لترسب الآخر.

يتم إعداد المحاليل المركزة بوزن الكميات المحددة (جدول 5) من الكيماويات التالية وإذابتها في لتر من الماء المقطر، بعض المواد العضوية يصعب إذابتها.

قد يكون الخلط الشديد باستخدام أداة تقليب ضرورياً للحصول على إذابة كاملة. بعد ذلك تستكمل الكمية بالماء. تخزن المركزات بدون تعديل الرقم الهيدروجيني (pH) لتقليل الترسيب، ومن الأفضل أن تصنع محاليلك المركزة بنفسك لتلافي أخطاء الآخرين في الوزن والأعداد.

جدول (5) يوضح الكيماويات التي تدخل في اعداد بيئة Murashige and Skoog (MS)

ـــــــــــــــــ

(*) يختلف اعداد مركزات محاليل F عن الانواع الاخرى. لاعداده: يذاب كل مكون في 200 مل من الماء المقطر، تسخن محاليل Na2.EDTA ثم يضاف اليها محلول FeSO4.7H2O ، عندما يبرد يخفف الى 1000 مل من الماء المقطر. لا يوضع هذا المحلول في الثلاجة قبل ان يصل الى درجة حرارة الغرفة. يجب استخدام زجاجة معتمة او مغطاة بورق الالومونيوم لحفظ هذا المحلول.

(**) Thiamin HCI : ارتفع عن 0.02 مجم/ لتر (MS, 1962) ، كما اوصى لونسماير وسكوج Linsmaier and Skoog 1965))

يجب ألا تضاف المحاليل المركزة إلى دورق فارغ أو به كمية قليلة من الماء، فهذا سيؤدى إلى ترسب الأملاح المعدنية. لنفس السبب يجب التقليب بشدة عند إضافة المحاليل المركزة.

تخزين المحاليل المركزة:

1- درجة الحرارة: من الأفضل حفظ جميع المحاليل المركزة بالثلاجة، خاصة الاوكسينات (auxins)، الفيتامينات، السيتوكينينات (cytokinins) والأملاح. يمكن تخزين إندول حمض الخليك (IAA) بالتبريد لأسابيع قليلة. يجب أن تستخدم ماصات نظيفة لتوزيع المحلول المركز. لا تستخدم أبداً محلول مركز ملوث لتكوين بيئة الزراعة. تحقق بشأن التلوث كلما استخدمت محلولاً مركزاً.

2- للتخزين: استخدم محاليل جديدة (طازجة) من ABA (حمض الأبسيسيك)، الجبريلينات (أسابيع قليلة على الأكثر)، وأيضا حمض الأسكوربيك والجلوتامين حيث إن جميعها غير ثابتة.

3- يخزن بعيداً عن الضوء : الأوكسينات ومحاليل مركبات الحديد والأملاح التي تساعد على نمو الطحالب بالمحلول.

خطوات العمل (البروتوكول): إذا كنت تستخدم قائمة مراجعة check lista يجب التأكد من: 1 – إضافة الكميات الصحيحة من المحاليل المركزة ٢- خففت إلى الكمية المطلوبة 3- ضبط الرقم الهيدروجيني pH ...إلخ. يمكن أن تكون جميع الأعمال الروتينية لإعداد البيئة جزءاً من هذه القائمة. يمكن توفير الوقت إذا أعددت عبوات من السكروز (۳۰جم) والمايو۔ اِينوسيتول (۱۰۰۰ مجم) مسبقاً.

٢– الإعداد من البيئات التجارية سابقة الخلط

البيئة التجارية المسحوقة شديدة الامتصاص للرطوبة، لذا يجب حمايتها من رطوبة الجو ان امكن، يجب استخدام جميع محتويات العبوة فور فتحها. لا ينصح بإعداد البيئة على شكل محلول مركز حيث يمكن أن تترسب بعض مركبات الأملاح. قد تؤثر الإضافات التي تضاف للبيئة على مدة صلاحيتها وحالتها. فيما يلى الخطوات الأساسية لإعداد بيئة الزراعة:

خطوات العمل (البروتوكول):

1- قم بقياس حوالى 90٪ من الحجم النهائي المطلوب من الماء الصالح لمزارع الأنسجة (مقطر مرتين)، مثال: ۹۰۰ مل لكمية نهائية ۱۰۰۰ مل. اختر وعاء ضعف الحجم النهائي.

2- عندما تقوم بتقليب الماء أضف مسحوق البيئة واستمر بالتقليب حتي تمام الذوبان، قد تحتاج للتسخين لتحويل المسحوق الى محلول.

3- اشطف الوعاء الأصلي بقليل من الماء المستخدم لزارعة الأنسجة وذلك لإزالة أية آثار للمسحوق. أضفه إلى المحلول في خطوة ٢.

4- أضف المواد المكملة التي لا تتأثر بالحرارة (مثل سكروز مادة هلامية "جلاتين"، فيتامينات، الأوكسينات والسيتوكينينات....إلخ).

5- أضف كمية أخرى من الماء للوصول للحجم المطلوب.

6- مع التقليب عدّل الوسط للوصول إلى الرقم الهيدروجيني (pH) المطلوب باستخدام NaOH (هيدروكسيد الصوديوم) آو HCl (حمض الهيدروكلوريلك) أو KOH (هيدروكسيد البوتاسيوم).

7- إذا استعملت مادة هلامية، سخن المحلول حتى يصبح لونه صافياً.

8- أفرغ محلول البيئة في أوعية الزراعة قبل (أو بعد) التعقيم تبعا لنوع العمل، أضف المكونات التي تتأثر بالحرارة بعد التعقيم.

9- عقم البينة بواسطة "الاوتوكلاف " عند ضغط ۱ كجام / سم2 (۱۵ باوند/ بوصة2) ودرجة حرارة ١٢١ م للمدة المحددة في طرق التعقيم.

10- اترك البيئة تبرد قبل الاستعمال.

التخزين

تخزن البيئة الجافة في مجفف عند 0– 5 م. يمكن ملاحظة التحلل في مسحوق البيئة: 1) تغير اللون 2) تكون حبيبات أو كتل أو جزيئات في المسحوق 3) عدم الذوبان 4) تغير الرقم الهيدروجينى 5) عدم القدرة على تحفيز نمو الخلايا رغم استخدامه بطريقة صحيحة.

الترسب في البيئة

من المعروف أنه مع الوقت يحدث ترسب في بيئة مزرعة الأنسجة النباتية، تم تحليل هذه الترسبات. تتكون من جزيئات باهتة بيضاء مصفرة. أوضح تحليل الترسبات غلبة الحديد، الفوسفات والزنك. يرجح أن سبب هذه الترسبات هو التأكسد الحتمي لأيونات الحديدوز إلى أيونات الحديديك. عندما يزيد التشبع بفوسفات الحديديك يحدث الترسب. لا توجد تقارير تأكيدية بوجود تأثير ضار للترسبات على النمو والتطور في مزارع الأنسجة النباتية.

قد يتطرق البعض إلى المفاضلة بين البيئة المعدة سالفا premixed media والتي تباع تجارياً والبيئة التي يمكن تكوينها من مركبات منفصلة Stocks فالبيئة الأولى تتميز بسهولة التحضير بحيث يتم وزن معين منها وإضافتها إلى الماء ثم تكملة الإضافات الأخرى بالإضافة إلى السهولة فلا يحدث خطأ في الكمية المضافة من كل مكون بالبيئة وهي لهذا مفضلة في المعامل التجارية لزراعة الأنسجة، أما في المعامل البحثية أو التجريبية فتميل إلى التحضير للعناصر المنفصلة Stocks ثم إضافتها بنسب معينة للحصول على التركيب الملائم وهي تعطي فرصة للتغير أو التعديل في نسب المكونات لإجراء هذه التجارب والوصول إلى تراكيب جديدة للبيئات مما قد يسمح بتعديل البروتوكولات لنباتات مختلفة

 (Murashige et al., 1972, De Fossard et al., 1974 and Huang and Murashige, 1976)

تعقيم بيئة الزراعة

خطوات العمل:

يتم تعقيم بينة الزراعة عادة باستخدام الاوتوكلاف عند درجة حرارة ۱۲۱م وضغطه 1.05 كجم / سم (1520 باوند / بوصة2). يعتمد الوقت المطلوب للتعقيم على كمية البيئة في الإناء جدول(6). الحد الأدنى للوقت المطلوب لتعقيم الكميات المختلفة مدرج أدناه. ينصح بتقسيم البيئة على دفعات صغيرة كلما أمكن حيث إن كثيراً من مكوناته تتكسر عند التعرض للحرارة لمدة طويلة. هناك دلائل أن البيئة التي تتعرض لدرجات حرارة أكثر من ١٢١م قد لا تتجمد المادة الهلامية بها بصورة صحيحة أو قد يؤدي هذا إلى نمو ضعيف للخلايا.

العديد من مكونات البيئة تعتبر حساسة للحرارة ويجب ألا تعقم. المحاليل المركزة للمكونات الحساسة للحرارة ترشح بعد اعدادها خلال مرشح معقم ۰٫۲۲ ميكرومتر إلى وعاء معقم. يضاف المحلول المرشح لبيئة الزراعة المعقمة في الأوتوكلاف بعد أن تبرد إلى 35-45م تقريبا. يتم تقسيم وصب البيئة بعد ذلك تحت شروط التعقيم.

جدول (6) يوضح حجم البيئة وزمن التعقيم الملائم

تعقيم المنفصل النباتي

طريقة العمل:

1. تغسل المنفصلات النباتية بمنظف خفيف قبل معاملته بمحلول مطهر (المادة العشبية قد لا تحتاج لهذه الخطوة).
2. تشطف المنفصلات النباتية جيدا بماء الصنبور الجاري لمدة 10-30 دقيقة.
3. تغمر المنفصلات النباتية في المحلول المطهر. اغلق الزجاجة باحكام ورجها برفق.
4. تستخدم مادة تويين 20 او 80 كمادة ناشرة تضاف مع المحلول المطهر حيث تقلل من التوتر السطحي وتسمح بتلامس جيد للمحلول مع سطح الجزء النباتي المراد تعقيمه. وتتم الخطوات السابقة في غرفة الإعداد preparation room)).
5. تحت ظروف التعقيم، أفرغ المحلول المطهر واشطف المنفصلات النباتية عدة مرات بماء مقطر معقم، تحت ظروف كاملة التعقيم (كابينة الزراعة المعقمة).

جدول (7) يوضح المواد المستخدمة في التعقيم السطحي للنسيج النباتي والتركيز الملائم والوقت المناسب

هناك العديد من بيئات زراعة الأنسجة لمحاصيل كثيرة تستخدم على نطاق تجاري في العديد من المعامل.

وعلى العموم إن الوصول إلى البيئة الملائمة لنمو وتكشف النسيج أو العضو النباتي بما تحويه البيئة من العناصر الغذائية المختلفة لهو المفتاح الأساسي في نجاح إكثار عديد من النباتات المختلفة باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة.

(*) محلول التبيض التجاري يحتوى على 5% Sodium hypochlorite وفي هذه الخالة ممكن استخدامه من ۱۰ -۲۰ ٪ وهي تمثل 0.5-10 ٪ صوديوم هيبوكلوريت.

(**) مركب كلوريد الزئبق يراعى أنه مادة خطرة جدا لكل من الإنسان والنبات وفي حالة الاضطرار إلى استخدامه يجب أخذ الاحتياطات الملائمة.

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.