تاريخ زراعة الانسجة النباتية

شهدت العقود الماضية اهتماما بالغاً بزراعة الأنسجة النباتية الذي بدأ ببداية القرن الماضي وتدرج ببطء حتى بداية السبعينيات ثم انطلق بعد ذلك، حيث تعتبر زراعة الأنسجة من الوسائل التي ساهمت بشكل جذري في تطور المحاصيل الزراعية بأنواعها المختلفة الذي ألقى بظلها على النمو الاقتصادي القومي والعالمي. ولا تقتصر أهمية زراعة الأنسجة فقط على الدراسات الأكاديمية للعلوم المختلفة والمرتبطة بالنبات مثل فسيولوجيا وسيتولوجيا النبات بل أيضاً دعم التكنولوجيا الحديثة مثل الهندسة الوراثية حيث بفضلها تطور علم وتكنولوجيا الهندسة الوراثية.

ففي عام ۱۹۰۲ قدّم العالم الألماني هيبرلاندرت "Heberlandt" وهو عالم متخصص في فسيولوجيا النبات مفهوما وجد نجاحاً عظيما في آخر الأمر وأصبح في هذه الأيام قاعدة لمزارع الأنسجة والخلايا النباتية، فلقد فصل أنسجة وخلايا نباتية من أجزاء مختلفة من النباتات ووضعها في بيئة صناعيه بسيطة من تكوينه تحتوي على أملاح معدنية وسكر، ولاحظ أن الأنسجة والخلايا التي وضعها في البيئة قد زادت في الحجم ولكنها لم تنقسم وقد يرجع هذا إلى عدم ملاءمة البيئة، ومع ذلك فإن نتائجه أدت إلى التنبه لظاهرتين هامتين:

أ) الظاهرة الأولى: تتضمن مفهوم القدرة الذاتية الوراثية لخلايا وأنسجة النبات لتنمو إلى نبات كامل وتسمى: "Totipotency" ولقد أشار هيبرلاندت إلى أن الخلية النباتية لها القدرة على النمو وتكوين نبات كامل، وتنبأ بأن العاملين في مجال زراعة الأنسجة النباتية في يوم ما سوف يجدون "الطريق لحث الخلايا النباتية لتظهر خاصةTotipotency  مزارع الأنسجة النباتية".

ب) الظاهرة الثانية: افترض هيبرلاندرت وجود منظمات النمو النباتية ولم يكن متعارف عليها أو عزلها بعد والتي تكون مسئولة عن انقسام الخلية النباتية وكذلك تميزها وتكشفها.

وعلى العموم فمن الناحية النظرية، فالعلماء متفقون على أن كل الخلايا لها المقدرة الذاتية على النمو وتكوين النبات الكامل، وللبعض القدرة أكثر من الآخر – وهذه غالبا ما تكون الخلايا المريستيمية، وهذه الأنسجة والخلايا إما أن تزرع في البيئة فيما يسمى المنفصل النباتي "Explant"، أو تنتج في مزارع الأنسجة النباتية.

في عام: 1934 عرف العلماء كوجل وآخرون Kogl (كوجلي، هاجن سميث واركسلبان) الهرمون النباتي الأول المعروف باسم إندول حمض الخليك (IAA) وهذا الهرمون له دور في استطالة الخلايا.

وفي عام 1939 استخدم هوايت White أيضاً في الولايات المتحدة الأمريكية ومجموعة آخري منافسة من فرنسا (نوبلكورت وجوثيريت Noblecourt & Gautheret) هرمونا نباتياً جديداً في بيئاتهم وأعلن كل فريق مستقل عن الآخر أنه يمكن إنتاج مزارع كالوس Callus غير محدودة النمو للأنسجة النباتية في البيئات الصناعية، ومنذ ذلك الحين فصاعدا وضع الأخصائيون في زراعة الأنسجة النباتية بيئات مناسبة لنمو كل نبات وذلك بعد إجراء تجارب على بيئات مختلفة للحصول على النمو الطبيعي للنبات ولكن في بعض الأحيان تقاوم بعض النباتات كل المحاولات للنمو.

شكل يبين الرعيل الاول من علماء زراعة الانسجة النباتية في بدايات القرن العشرين

أشار أوفربيك وآخرون Van-OVerbeek في عام 1941 أن لبن جوز الهند المعقم يشجع نمو الكالوس لأجنة نبات الداتورة المفصولة، وسريعا ما امتد عمل الآخرين ليستخدموا الاوكسينات وجوز الهند واصبح تكوين الكالوس ممكنا علي نطاق واسع من الأنسجة النباتية المختلفة.

وعرفت مركبات السيتوكينين كمنظمات نمو تساعد وتشجع انقسام الخلايا، ولم تكن العلاقة بين الاوكسينات والسيتوكينينات معروفة للعلماء حتي أوائل الخمسينيات، ولاكتشاف السيتوكينين بواسطة كارلوس ميلر Miller عام 1955 الذي كان يعمل مع فولك سكوج في معمله في جامعة ويسكنسون دوراً هاماً في إحلال الكينتين محل لبن جوز الهند في بيئة نبات البسلة وأصبح من الممكن للنباتات أن تنمو في بيئة معروفة التركيب كلية.

وقد وضع ميلر وسكوج Miller & Skoog أساسيات زراعة الأعضاء النباتية في عام ١٩٥٧، وأوضحا أن هناك علاقة هامة بين الأوكسين والسيتوكينين لنمو النبات، ففي مرحلة التضاعف وتكوين الافرع تزاد نسبة السيتوكينين عن الاوكسين والعكس في مرحلة تكوين الجذور، وجسد هذا العمل بتكوين كالوس من أنسجة نباتات الدخان.

وفي عام 1958 ظهر كل من ثيمان وويكسن  Thimann and Wicksonفي جامعة هارفارد وذكرا أن السيتوكينين يبطل مفعول السيادة القمية ولقد استخدموا الكينتين للبراعم الجانبية حيث أبطل السيادة القمية.

وعند فصل الجزء النباتي (مجموعة من الخلايا أو عضو نباتي يشمل بعض الأنسجة المريستيمية - كامبيوم - القمة المريستيمية) في بيئة صلبة أو سائلة تبدأ الخلايا في الانقسام والاستطالة وهذه الزيادة تكون بدون اتجاه إذا لم تصبح النسبة بين الأوكسين والستوكينين الموجودة في البيئة ملائمة لنمو وتكشف الأعضاء، وعادة ما تكون الأنسجة المريستيمية مصدر نمو النسيج المجروح والتي تكون موجودة وجرحت وهذا النمو للخلايا لا يحدث في الطبيعة بسبب نمو البكتيريا على الأنسجة المجروحة والتالفة وقد يتجه النسيج إلى تكوين طبقه فلينية أو إفرازات صمغية لعلاج الجروح، وأما في البيئة المعقمة والمحتوية على المواد المغذية يكون هذا النسيج قادرا على النمو.

ولقد كان العاملون الأوائل في مجال زراعة الأنسجة النباتية مغرمين بتكوين أشباه الأورام "Tumor formation" بدون اتجاه معين لنمو الأنسجة وغالباً ما يتخذ نمو الخلايا في مزارع الأنسجة شكلاً غريباً وهذا بسبب الخلايا المجاورة وضغطها لجدار الخلية وكذلك ضغط الخلايا على بعضها ويحاول العلماء فهم كيفية تكوين الأورام في مزارع الأنسجة وبالتالي يمكنهم حل مشكلة تكوين الأورام السرطانية في الإنسان، ولكن حتى الان فإن تطبيق هذه الدراسة على النبات لم ينتج هذا النوع من المعلومات.

واليوم يمكننا المحافظة على الكالوس باستمرار وذلك بنقله إلى بيئة جديدة طازجة، ومن المعروف لدينا أن الكالوس يتكون مبدئياً من الخلايا البرنشيمية بأشكال وأحجام مختلفة ويحدث النمو في خلايا الكامبيوم أو "عشوائيا" في خلايا الانقسام المتناثرة، وهناك اعتقاد خاطي بأن مزارع الكالوس عبارة عن خلايا غير متكشفة، وهذا نادر اما يكون "حقيقيا" حيث يتكون الكالوس من العديد من أنماط الخلايا المختلفة ومراكز النمو المريستيمية في الكالوس تتكشف إلى أفرع أو جذور تسمى هذه المراكز المريستيمية "meristemoids" وهذا طبقا لتسمية "Torrey" عام ١٩٦٦، والخلايا ذات سيتوبلازم كثيف وأنوية حية وقليل من الفجوات وهي عبارة عن تجمعات من الخلايا مثل العشوش.

وبالعكس فان معظم الخلايا المزروعة تكون ذات حويصلات متميزة متباينة في الشكل والحجم وينقصها نواة واضحة وكذلك السيتوبلازم ولها جدران خلوية ذات درجات مختلفة من الترسيبات ولوحظت ظاهرة هامة في مزارع الكالوس حيث كانت تكشف خلايا الكالوس إلى أفرع يتبعها تكوين الجذور.

ومزارع الكالوس لكثير من الأنواع النباتية عادة ما تكون غير قادرة على النمو إلى أعضاء حيث إن هذا الكالوس ينقصه خلايا ال "meristemoids" أو الخلايا القادرة على التحول إلى هذه الخلايا وهي من الأشياء الشائعة الحدوث في مزارع الأنسجة النباتية نتيجة عدم التزامن بين انقسام الخلية وانقسام النواة والذي يؤدي إلى ظهور خلايا عديده الأنوية.

ويمكن إنتاج مزارع من الخلايا الحية الحرة والتجمعات البسيطة وتكوين العديد منها وذلك عند نقل الكالوس إلى البيئة السائلة. وفي عام ١٩٥٦ كان نيكل "Nickel" أول من قدم تقريراً عن زراعة خلايا الفول في بيئة سائلة "liquid Suspension culture" مع رج البيئة باستمرار على هزاز يؤدي ذلك إلى انفصال الخلايا، وعلى ذلك يوصي بالرج المنتظم للبيئات السائلة.

ولقد كان بيرجمان "Bergmann" عام 1960 أول من قام بتفريد خلايا معلقات المزارع النباتية على بيئة الأجار المغذية، واليوم يمكننا فصل الخلايا الفردية وترشيحها وكذلك تفريدها على بيئة الأجار للحصول على خطوط للخلايا أو مستعمرات الخلايا (كما يحدث في حالة زرع البكتيريا والفطريات) وهذه الخلايا عادة تختلف في الشكل والحجم والبعض أكثر ثباتا وراثياً عن الآخر وقد يتميز البعض منها بتعدد الكروموسومات "polyploid".

ولقد قامت ثلاث مجموعات من العلماء بالعمل على خلايا الجزر معمليا مكتشفين ظاهرة تكوين الاجنة اللاجنسية "somatic embryogenesis" ومن هؤلاء العلماء "Reinert" رينرت عام ۱۹۵۹ من ألمانيا وستيوارتStewardt" " عام 19٦٤ من الولايات المتحدة الأمريكية وهالبيرن وويتريل  Halperin & Watherell" " عام 1964 من الولايات المتحدة أيضاً، ولقد كان لستيوارت وتلاميذه الفضل الأكبر في هذا الاكتشاف – ولقد كان هذا الاكتشاف مثيرا إلى أبعد حد، فلقد لاحظ العلماء أن خلايا الجزر (خلايا فردية ومجموعات صغيرة من الخلايا) تنمو في مزارع المعلقات والتي تكشفت إلى أجنة، ونحن نعلم من علم الوراثة التقليدي أن الأجنة (أجنة الزيجوت) عبارة عن بويضة (خلية) تحتاج إلى حبة اللقاح (الخلية الذكرية) لتخصب وتنتج الزيجوت وبالتالي ينمو الجنين خلال عدة مراحل وهي: الجنين الكروي globular embryo"" ، الجنين القلبي heart shaped embryo ، مرحلة الطوربيدو "torpedo stage" ، المرحلة الفلقية "cotyledonary stage"

وكما نعلم فان الحاميطات أحادية الكروموسومات وعند الإخصاب تصبح ثنائية الكروموسومات وتعطي نباتات عادية - وهذا الوضوح الشديد يعزز مفهوم هيبرلاندت لنظرية (القدرة الوراثية الذاتية للنسيج النباتي لتنمو لنبات كامل) والتي تكرر بوضوح الآن مع كثير من الأنواع النباتية.

وعملية تكوين الأجنة الجسمية أصبحت من مجالات البحوث الهامة ذات الشهرة في هذه الأيام ومن المتوقع أن يكون لها تأثير عظيم في إكثار النباتات حيث تعتبر طريقة من طرق التكاثر الخضري تساعد علي اكثار النباتات المرغوب في اكثارها وذلك بتكوين الأجنة في مزارع الأنسجة أو في مستعمرات كبيرة، وتجمع هذه الأجنة من البيئة وتغلف وتتداول مثل البذور، ومن الممكن الآن استخدام هذه الأجنة المغلفة لبعض الأنواع النباتية حيث أصبحت حقيقة واقعة.

ولقد قامت مجموعتان بحثيتان - كل مجموعة مستقلة عن الأخرى - باكتشاف إمكانية الحصول على النباتات الأحادية من زراعة حبوب اللقاح في بيئة مناسبة ولقد كانت المجموعة البحثية الأولى في فرنسا وذلك في الفترة من 1963 – 1969، وهذه المجموعة مكونة من أحد العلماء الفرنسيين وزوجته (نيتش ونيتش) Nitsch and" "Nitsch ولقد نشرا معاً مجموعة من الأبحاث حول إمكانية الحصول على النباتات الأحادية لزراعة حبوب اللقاح لنبات الدخان.

والمجموعة البحثية الثانية كانت في الهند عام ١٩٦٤، وكانت مكونة من جحا وماهشوري " Guha and Maheshwari" وكانت أبحاث هذه المجموعة في الحصول أيضاً على نبات الداتورة الأحادية من حبوب اللقاح، ولقد فتح هذا آفاقا جديدة لمربي النباتات للحصول على نباتات نقية وذلك بنمو نباتات أحادية الكروموسومات ثم مضاعفة الكروموسومات بمعاملتها بالكولشيسين وبالتالي تصبح نباتات "diploid" (ثنائية الكروموسومات) نقية وراثياً تصلح لجميع أنواع التجارب، ولقد اعتبرت هذه الفترة فترة ازدهار لزراعة الأنسجة حيث اقترنت هذه الأبحاث مع أبحاث إنتاج أجنة جسمية وطبقت هذه الأبحاث في كندا على نبات البروكلي ونبات الكانولا.

وفي عام 1962 نجح موراشيجي وسكوج  ""Murashige & Skoog من جامعة ويسكونسن بالولايات المتحدة الأمريكية في تكوين بيئة معدلة وصالحة لزراعة خلايا الكالوس لنبات الدخان وهذا البحث يعتبر جزءاً من رسالة الدكتوراه لموراشيجي مما أدى بها إلى الشهرة، ويعتبر هذا البحث أهم مرجع في مجال زراعة الأنسجة النباتية حتى الآن، ولقد احتوت هذه البيئة على كل من العناصر الضرورية الكبرى والصغرى للنبات وكذلك على مواد عضوية مثل الحامض الأميني جليسين وكذلك ثلاثة أنواع من الفيتامينات مثل الثيامين "thiamine" والبيرودكسين "pyridoxine" والنياسين وهو حمض النيكوتين nicotinic acid والسكروز كمصدر كربوهيدراتي وكذلك احتوت علي هرمونات نباتية وهي الاكسين "auxin" وسيتوكينين "cytokinin" وهذه البيئة مع بعض التعديلات في مستوى الهرمونات تصبح مناسبة للعديد من النباتات من نباتات المنطقة المعتدلة إلى الاستوائية ومن عشبية إلى خشبية، وهذا لا يعني أن كل النباتات تنمو نموا جيداً في هذه البيئة، ولكن يتوقف هذا على مهارة وخبره الباحث في هذا المجال، وعلى التجربة ومحاولات متعددة لتطوير البيئة المطلوبة.

وبدأت دراسة تطبيق مزارع الأنسجة النباتية على المحاصيل الزراعية مع أبحاث جورج موريل "George Morel" في فرنسا عام ١٩٦٦ وعلى نباتات الأوركيد بالتحديد لإنتاج نباتات خالية من الأمراض الفيروسية، فلقد فصل جزءاً صغيراً من القمة المريستيمية وزرعها في البيئة، وهذه الخلايا المرستيمية انقسمت بسرعة كبيرة أسرع من انقسام الفيروس وبالتالي كانت خالية من الفيروس أو على الأقل نسبة منها كانت خالية من الفيروس.

ونستطيع أن نقول أن جورج موريل توصل لاكتشافين، الأول: إنتاج نباتات خالية من الفيروس وذلك بزراعة القمة المرستيمية. والثاني: الحصول على أعداد كبيرة من النباتات لكل مريستيم.

ولقد كان لهذه الاكتشافات التأثير العظيم في مجال زراعة الأنسجة النباتية، ولقد اهتم بهذه الاكتشافات علماء الفيرولوجي، وانحصر اهتمامهم في إنتاج نباتات خالية من الأمراض وكذلك اهتم علماء البستنة وانحصر اهتمامهم كذلك في إكثار أعداد كبيرة من نباتات الزينة ومجموعة أخرى من النباتات الاقتصادية الهامة.

وفي هذه الأيام تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع لإنتاج نباتات خالية من الأمراض وكذلك الإسراع في طرق تربية النباتات وتهجينها، ولا تزال حتي اليوم تستخدم زراعة الأنسجة النباتية لهذين الهدفين:

1) إنتاج وحفظ نباتات خالية من أمراض معينة.

٢) الإكثار والإنتاج السريع للنباتات بأعداد وفيرة.

ولقد صاحب نجاح زراعة الخلية في البيئة الحديثة نجاح زراعة البروتوبلاست، وذلك بإزالة الجدار الخلوي للخلية والمكون من مواد سليولوزية صلبة محيطة بغشاء الخلية، ويزال هذا الجدار الخلوي عادة باستخدام الإنزيمات، ويجب الاهتمام بملاحظة الضغط الأسموزي للمخلوط الإنزيمي وأيضاً في بيئة الزراعة - والخطوة الثانية دمج البورتوبلاست ") "protoplast fusionتهجين الخلايا الجسمية) وتكوين (cybrids) ويستخدم لذلك مادة بولي اثيلين جليكول "polyethylene glycol " كما أشار كاو وميكايوك 1974Kao and Michayluk" " وفي بعض الحالات تستعمل زراعة البروتوبلاست لتسترد الخلايا إلى ما كانت عليه وفي بعض الحالات الأخرى يكون الهدف إنتاج نباتات بمواصفات معينة.

وفي عام ۱۹۷۸ توصل مجموعة من العلماء - ميلشيرز وسكرتيان وهولدر - الي انتاج نباتات مهجنة باستخدام زراعة الأنسجة النباتية من خلال إدماج بروتوبلاست البطاطس والطماطم وتقتصر التهجينات الناجحة باستخدام اندماج البروتوبلاست على التهجينات التي تتم بالطرق التقليدية وحتى الآن نعتبر غير قادرين لتخليق نمط وراثي غير طبيعي باستخدام تكنيك البروتوبلاست، وهذا يدل على وجود مشكلة بيولوجية معقده لا يمكن حلها ببساطة من خلال إزالة الجدار الخلوي، وعلى العموم النباتات المهجنة عن طريق دمج البروتوبلاست كثيرة ومنها الجزر، والدخان، والبوتينيا.

جدول يوضح أهم علماء زراعة الأنسجة النباتية وإنجازاتهم

القائمة السابقة (الجدول) توضح اهم علماء زراعة الانسجة النباتية وانجازاتهم خلال فترة وضع حجر الاساس من اوائل الثلاثينيات الى اوائل الثمانينيات من القرن الماضي بعد ذلك حدث تطور سريع في التطبيقات المختلفة في مجال تربية النباتات وانتاج البذور الصناعية واكثار النباتات التي كانت لا تنمو في الماضي في بيئات الزراعة بل اتجهت الى التطبيقات التجارية ثم حدث تطور اخر سمح بإمكانية تعديل النباتات وراثيا خلال تطبيقات الهندسة الوراثية.

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.