وصمة وسترن Western Blot

طريقة تقدير مناعي لتحديد الكميات الصغيرة من البروتينات والطريقة تستعمل للكشف والتحري عن بروتينات معينة بين خليط من البروتينات . وتعتمد الطريقة على استعمال الأجسام المضادة Antibodies ولذلك تسمى بعض الأحيان Protein Immunoblot والطريقة استحدثت وطورت من قبل G. Stark والتسمية أعطيت من قبل W.N. Burnette كمحاكاة لوصمة Southern Blot التي وصفت من قبل Edwin Southern للكشف عن DNA . وفيها يتم فصل البروتينات المطلوبة باستعمال وسائل عدة أهمها فصل البروتينات على هلام الاكريلامايد بوجود عامل مسخ مثل SDS-PAGE) Sodium Dodecyl Sulfate) ويمكن فصل البروتينات ايضا من دون استعمال العوامل الماسخة SDS ويكون الفصل بالاعتماد على حجم التواليات الببتيدية ( الوزن الجزيئي ) او بالاعتماد على تركيب البروتين ثلاثي الأبعاد ، او بالاعتماد على نقطة التعادل الكهربائي Isoelectric Point وإقرانها بطرق أخرى أي الاستعمال الفصل ثنائي الاتجاه 2D Electrophoresis ، وعلى العموم فان طريقة الفصل تعتمد على طبيعة النموذج والهلام الذي سيتم الفصل فيه .
والخطوة الأخرى هي نقل البروتينات المفصولة إلى أغشية خاصة وأكثرها استعمالا هي أغشية نترات السيليلوز Nitrocellulose لتلتصق البروتينات اليها بتكوين أواصر تساهمية او يكون الارتباط معتمدا على الشحنات التي تزداد عند انخفاض الرقم الهيدروجيني ، وبعد هذه الخطوة تجري عملية الإغلاق أي معاملة أوراق السليلوز بألبومين المصل ألبقري المخفف مع منظف مثل Tween 20 لغلق المواقع الشاغرة على أوراق السليلوز ومنع التصاق الأجسام المضادة التي ستضاف في الخطوات اللاحقة من الارتباط إلى أغشية السليلوز باعتبارها مواد بروتينية مما يؤدي الى ظهور نتائج ايجابية كاذبة .
ثم تضاف الأجسام المضادة الأولية Primary Antibodies لترتبط بشكل متخصص للبروتينات المعنية ( اذ تكون الأجسام المضادة قد انتجت ضد البروتينات المعنية النقية في احد الحيوانات الملائمة )  وتضاف الأجسام المضادة الأولية بتراكيز واطئة تصل من 0.5-5 مايكروغرام / مللتر مع التحريك البسيط ولمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى 24 ساعة ( والمدة تحدد بالتجربة ) وبدرجات حرارة ملائمة والحرارة المرتفعة توفر عمليات ارتباط أسرع وأفضل ، بعد ذلك تغسل الأغشية لإزالة الفائض من الأجسام المضادة الأولية ، ثم تعرض الأغشية إلى الأجسام المضادة الثانوية Secondary Antibodies وهي أجسام مضادة تنتج ضد بروتينات الأجسام المضادة الأولية في الماعز او الفئران او في مزارع الخلايا الهجينة Hybridoma لذلك تسمى Ati-Mouse اوAnti-Goat.
وتستعمل الأجسام الثانوية بعد تعليمها بوسائل عدة مثل استعمال المواد المشعة كما في استعمال Staphylococcus Protein A المرتبط إلى اليود المشع ، او تربط الأجسام إلى إنزيمات الإعلان Reporter Enzymes مثل Horseradish Peroxidase او Alkaline Phosphatase لتحديد كمية الأجسام الثانوية المرتبطة . فعند إضافة الأجسام المضادة الثانوية إلى الأغشية أعلاه فانها سترتبط بالأجسام المضادة الأولية التي ارتبطت بالبروتينات المعنية أي يكون الترتيب :

بروتين مطلوب - أجسام مضادة أولية - أجسام مضادة ثانوية (معلمة او مقترنة)

ثم بعد ذلك يتم الكشف عن الفعالية باستعمال طريقة الاليزا ELISA او استعمال أفلام الأشعة السينية في حالة استعمال المواد المشعة . والخطوات مختصرة في الشكل الاتي :