عزل وتشخيص الأحماض النووية الفايروسية

لدراسة الحامض النووي الفايروسي فانه يجب أن يعزل نقيا ويفصل عن بقية مكونات الفايروس وخاصة بروتين الكابسيد وهذه العملية قد تعرض الفايروس لمخاطر التلف الميكانيكي Shearing أو التحلل الإنزيمي بإنزيمات التحلل أو التلف بتأثير الظروف القاعدية أو الحامضية المتطرفة وهي قيم الأس الهيدروجيني دون 3 وفوق 10 حيث يتم فصل الأدنين عن الكوانين في الحوامض مزدوجة الخيط عند انخفاض قيمة الأس الهيدروجيني دون 3 ويطلق على هذه الظاهرة "إزالة البيورين" Depurination، فيما يتفكك الرنا الفايروسي فوق القيمة 10 بتأثير التحلل المائي القلوي، أما الدنا الفايروسي فانه يتفكك بعد القيمة 12، كذلك تؤثر أيونية المحلول على عزل وثباتيه الحامض النووي الفايروسي حيث ينفصل الخيطين المزدوجين للفايروسات مزدوجة الخيط بنوعيهما الرنا والدنا وكذلك تنفك ازدواجية عروة الحامض الرايبي مفرد الخيط الملتف على نفسه Double Stranded Ioop عند القوة الأيونية المنخفضة جدا، وإن هذه الدنترة التي تفك خيطي الحامض المزدوج ستزيد من حساسيته للتحلل بإنزيمات النيوكلييز، كذلك تسبب بعض الكاتايونات الفلزية ومنها أيون المغنيسيوم تجمعا لجزيئات الأحماض النووية الفايروسية وبالتالي فقدها أثناء العزل، وتحصل الحالة ذاتها عند القوة الأيونية العالية التي تزيد عن مولر واحد. تستعمل عادة إحدى الطرق الثلاث التالية لعزل الأحماض النووية الفايروسية نقية عن بقية المكونات الفايروسية وهي تجري علي المحلول الفايروسي النقي.

1. طريقة الملح الساخن

استعملت طريقة الملح الساخن Hot Salt method لأول مرة لفصل الحامض النووي لفايروس موزانيك التبغ (TMV) من قبل Knight سنة 1975 وهي طريقة شديدة لا تتحملها معظم الفايروسات باستثناء الثابتة منها لأنها تنفذ تحت درجة حرارية عالية تصل إلى 100م حيث يغلى المحلول الفايروسي مع محلول كلوريد الصوديوم تركيز 0,3 مولر لمدة دقيقة ثم يبرد فورا تبريدا شديدا ويفصل عن البروتين الفايروسي بالانتباذ على قوة 10000 g الذي يترسب تاركا الحامض النووي في الرائق الذي تتم ديلزته Dialysis لإزالة ايونات الصوديوم والكلوريد، يمكن استعمال الايثانول المبرد 67% لترسيب الحامض النووي ثم تعاد إذابته بالماء، إن هذه الطريقة تضمن الحصول على حوالي 80% من الحامض النووي الفايروسي.

2. طريقة مساحيق التنظيف

استعملت طريقة مساحيق التنظيف Detergent method من قبل Frankel-Conrat سنة 1957 لفصل الحامض النووي لفايروس موزائيك التبغ بتسخين المحلول الفايروسي النقي مع كبريتات دوديسيل الصوديوم SDS) Sodium dodecy Sulphate) بتركيز 2% عند درجة 55م و أس هيدروجيني 8,8 ولمدة خمسة دقائق فيفقد المحلول مظهره التلؤلؤي ثم يبرد إلى درجة 25م ويرسب البروتين الفايروسي بواسطة كبريتات الامونيوم ويبقى الحامض النووي في الرائق بعد الانتباذ على قوة 10000 g.

3. طريقة الفينول

تعد طريقة الفينول Phenol method أكثر الطرق شيوعا لفصل الأحماض النووية بمزج المحلول الفايروسي مع مقدار بنفس حجمه من محلول الفينول تركيز 80% لمدة 15 دقيقة ثم الانتباذ على قوة 10000 g لعدة دقائق حيث سينفصل الحامض النووي في الطبقة المائية العليا في أنبوبة الانتباذ.

4. تشخيص الحامض النووي الفايروسي

يشخص الحامض النووي الفايروسي لمعرفة نوعه وتركيبه وذلك بعد فصله نقيا بإحدى الطرق أعلاه ويتم ذلك بتحديد نسبة البيريميدينات والبيورينات فيه وذلك بإجراء تحليل مائي Hydrolysis للحامض النووي إما بالطريقة الحامضية أو القاعدية ثم فصلها بتقانات الكروماتوغرافيا الورقية أو بأعمدة الفصل الهلامي أو بالترحيل الكهربائي، وتستعمل حاليا تقانة تفاعل تسلسل البوليميريز " PCR أو تفاعل تسلسل البوليميريز بالاستنساخ العكسي" RT-PCR بشكل واسع لمعرفة التعاقبات النيوكليوتايدية للأحماض النووية الفايروسية ومعرفة خارطتها الجينية، كما إن إحدى الطرق الشائعة لتشخيص الحامض النووي الفايروسي هي معرفة نوع مجموعته الطرفية End group determination حيث يعطى اسم لكلا نهايتيه اعتمادا على رقم ذرة الكربون غير المشغولة في سكر الرايبوز أو الرايبوز منقوص الأكسجين لأخر نيوكليوتايدة طرفية لذا تسمى إحدى النهايتين بالنهاية55 end  والنهاية الأخرى بالنهاية3 3 end ويعتمد ذلك على وجود مجموعة الهيدروكسيل الحرة على ذرتي الكربون رقم 3 و 5.