تشخيص الفايروسات النباتية بدراسة الخواص الكيموفيزياوية للفايروس

يمتلك كل نوع فايروسي خواصا كيموفيزيائية مستقلة قابلة للقياس تعتمد على طبيعة تركيبه وهيكليته والتي توظف لتشخيص الفايروسات وهي:

1. كثافة الفايروس

تقاس كثافة الفايروس Virus density إما في الماء أو في محلول السكروز أو كلوريد السيزيوم Cesium Chloride ويستفاد من قيمة كثافة الفايروسات في معرفة نسبة الحامض النووي في جسيمة الفايروس ووجد أن نوع المحلول المستعمل لقياس الكثافة قد يؤثر على قيمتها أي أن قيمة كثافة فايروس معين تتغير بتغير نوع المحلول المذاب فيه الفايروس وهذا ما لوحظ بشكل خاص مع كلوريد السيزيوم.

2. معامل الترسيب ومعامل الانتشار للفايروسات

 Diffusion coefficient & Sedimentation coefficient

يعد معاملي الترسيب والانتشار من القياسات المهمة لمعرفة كتلة وشكل وكثافة الفايروس وهما من القياسات الهايدروديناميكية Hydrodynamic measurements ويقاسان بمعادلة "سفيدبيرج" Svedberg وهي معادلة فيزيائية تعتمد على قيم عديدة أهمها معامل انتشار الجسيمات الفايروسية في أحد المحاليل المذكورة في الفقرة السابقة وكذلك معامل ترسيبها فيه وكثافة الفايروس والحرارة المطلقة وحجم الفايروس وتستعمل لهذا الغرض تقانة الانتباذ التحليلي Analytical Centrifugation على سرعة عالية وباستعمال محلول متدرج الكثافة من السكروز أو كلوريد السيزيوم ثم مقارنة المسافة التي ترسب عندها الفايروس في مدرج المحلول ومقارنة ذلك مع مركب معلوم معامل الترسيب ترسب في نفس المسافة التي ترسب فيها الفايروس.

3. دراسة طيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية

إن الطيف الامتصاصي للأشعة فوق البنفسجيةUltraviolet absorption Spectrum  لكل فايروس هو مزيج الطيف الامتصاصي لهذه الأشعة من قبل الحامض النووي والكابسيد (الشكل 1) حيث تصل الامتصاصية القصوى للأشعة فوق البنفسجية من قبل الاحماض النووية عند الطول الموجي 260 نانومتر ويمتد نطاقها إلى الطول الموجي 230 نانومتر بينما يكون أعلى طيف امتصاصي للبروتينات عند الطول الموجي 280 نانومتر ويمتد نطاقها إلى الطول الموجي 250 نانومتر، ويتباين امتصاص الأحماض النووية للأشعة بين 20-25 وحدة امتصاصية (رمزها A) لكل ملغم فايروس في مللتر واحد من المحلول الفايروسي النقي عند الطول الموجي 260 نانومتر وهي بذلك أعلى بكثير من امتصاصية البروتينات التي تبلغ وحدة امتصاصية واحدة لكل ملغم فايروس/مل من المحلول الفايروسي عند الطول الموجي 280 نانومتر، وبذلك فان حاصل جمع القيمة الامتصاصية لكلا الطيفين يعطي الطيف الامتصاصي النهائي للفايروس الذي تصل قمته عند حدود 260 نانومتر ويمتد نطاقه بين 340-230 نانومتر، (الشكل 1) تعتمد قيمة الطيف الامتصاصي على نسبة الحامض النووي إلى البروتين فكلما زادت نسبة الأول في الجسيمة زادت هذه القيمة، كذلك تعتمد على أنواع الأحماض الأمينية الداخلة في تركيب البروتين.

إن هذا الاختبار لا يعطي دليلا تشخيصيا قويا للفايروس المعني وذلك لأن الفايروسات المتباعدة القرابة قد تتماثل في التركيب البروتيني وبذلك سيكون لها قيمة طيف امتصاصي متماثلة ورغم هذه السلبية أي عمومية نتائج هذا الاختبار إلا أنه يوفر معلومات مفيدة عن نقاوة الفايروسات في محاليلها والكشف عن وجود الملوثات النباتية في المحاليل الفايروسية النقية وخاصة الأحماض النووية والبروتينات النباتية والرايبوسومات.

4. دراسة الحركة الترحيلية الكهربائية للجسيمات الفايروسية

الحركة الترحيلية الكهربائية Electrophoretic mobility هي صفة لقدرة الجسيمات الفايروسية على الحركة في هلام يوضع في حقل كهربائي تمتاز بها كل البروتينات والأحماض النووية والتي وظفت لدراسة خواصها بواسطة تقانة الترحيل الكهربي Electrophoresis وأكثر أنواع الهلامات استعمالا هما "هلام البولي أكريل أمايد" , PAGE Polyacrylamide gel والاكاروز، وتعتمد حركة الجسيمات في الهلام على النووية الفايروسية إلى مجاميع الفوسفات والتي تؤدي إلى حركة تلك الاحماض باتجاه الأنود وعموما فان الجزيئات الصغيرة هي الأقدر على الحركة الأسرع خلال ثقوب الهلام مقارنة بالجزيئات الأكبر وبذلك يتم فصل الجزيئات اعتمادا على حجمها وبالتالي سرعة حركتها في الهلام، واعتمادا على ذلك يمكن تشخيص الفايروس من خلال نمط وموقع الحزمة التي يكونها اعتمادا على المسافة التي يقطعها في الهلام وعادة ما تكون سرعة حركة الفايروسات المتباعدة القرابة متباينة في الهلام مما يساعد في تمييزها حيث أن لكل مجموعة تصنيفية فايروسية نمط انتشار يميزها عن غيرها إلا أنه من الصعب التمييز بين السلالات التابعة لنوع فايروسي معين لتماثل حركتها في الهلام بسبب تماثل تركيبها البروتيني كما يستفاد من هذه الطريقة في معرفة طبيعة ونوع البروتينات والأحماض النووية الفايروس بتمريرها في الهلام مع مركبات قياسية معروفة الوزن الجزيئي Markers، ويوضح الشكل (2) مخططا لاختبار الترحيل الكهربائي.

الشكل (1): أطياف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية من قبل الفايروسات.

(أ) منحنيات الطيف الامتصاصي لمحاليل (1) الحامض الرايبي لفايروس الموزائيك الأصفر للشلغم TYMV)) (2) الجسيمات الكاملة للفايروس والتي تحوي 33% حامض نووي (3) جسيمات فايروس موزائيك الخيار (CMV) والتي تحوي 19% حامض نووي (4) جسيمات فايروس موزائيك التبغ (TMV) والتي تحوي 5% حامض نووي (5) الجسيمات البروتينية الفارغة الخالية من الحامض النووي لفايروس الموزائيك الأصفر للشلغم. (ب) منحنيات الطيف الامتصاصي الثلاثة للفايروس النقي والذي بتركيز ملغم واحد / مل في المحلول علما بان هذا الفايروس يحوي 20% حامض نووي، وللحامض الرايبي النقي المعزول RNA لهذا الفايروس، أما المنحنى الأخر فهو للبروتين الفايروسي النقي المعزول. لاحظ أن الذروة الامتصاصية الثانية في منحنى البروتين تعود إلى الامتصاصية المتسببة عن الحامض الاميني "التربتوفان". تشير الارقام المثبتة على المحور الصادي إلى قيم الامتصاصية.

الشكل مقتبس من Hull ((2002.

الشكل (2): تقانة الترحيل الكهربي للأحماض النووية والبروتينات. تضاف محاليل المركبات إلى الهلام لتبدأ جزيئاتها بالحركة في الحقل الكهربائي الموضوع فيه الهلام وذلك اعتمادا على نوع الشحنة الموجودة على سطحها.

الشكل مقتبس من Cann ((2005.