استعمال البكتريا الزراعية Agrobacterium tumefaciens

تستعمل البكتريا لغرض هندسة النباتات وراثيا، وذلك لصعوبة اجراء التغييرات على النباتات الكاملة لأنها تأخذ وقت طويل الى ان يحين ظهور تأثير التضريب والتهجين، كما انه ليس من السهولة التعامل مع الخلايا النباتية ومزارعها. وهذه البكتريا يمكن ان تساعد في التغيير الوراثي لأنها تستطيع ان تنقل جزء من جينومها الى جينوم الخلايا النباتية وتعد هذه عملية طبيعية لتجاوز الحواجز بين الاحياء وتعد من أهم مظاهر الهندسة الوراثية وهي التي شجعت فيما بعد اجراء عمليات نقل الجينات بين الاحياء البعيدة.

والبكتريا تعد وسيلة فاعلة لنقل الجينات الى النباتات ويقسم الجنس Agrobacterium الى عدة أنواع اعتمادا على الاعراض التي تظهرها على النباتات المصابة وكذلك المضايف التي تصيبها ومنها :

• Ag. tumefaciens تولد الورم التاجي Crown gall لعدد من النباتات.
• Ag. rhizogenes تسبب مرض الجذور الشعرية Hairy root disease لعدد من النباتات.
• Ag. radiobacter بكتريا لا تسبب الامراض.
• Ag. rubi تسبب الورم في قصب السكر.
• Ag. vitis تسبب الورم في الاعناب.

والورم يحدث نتيجة وجود البلازميد الحاث للورم (Ti plasmid) Tumor induced plasmid ، واستبدال البلازميد يمكن ان يغير الاعراض، كما ان اخراجه يجعل البكتريا غير ممرضة للنبات، وادخال البلازميد Ri المسئول عن مرض الجذور الشعرية الى الخلايا يؤدي الى توليد الورم ولكن بمظهر مختلف. وبهذا الوضع يصبح تصنيف الجنس الى انواع غير مجديا وذلك لأن الأسس الموضوعة للتصنيف تعتمد على البلازميد، وعليه اعتمدت مواصفات اخرى للتصنيف مثل صفات النمو والمسارات الايضية لتقسم الجنس الى biovar :

biovar I يضم معظم سلالات Ag. tumefaciens و Ag. rubi

biovar II ويضم بكتريا Ag. rhizogenes .

biovar III يضم البكتريا Ag. vitis

ونظرا لأهمية Ag. tumefaciens كوسيلة لهندسة النباتات وتحويرها ففي أقل من 20 سنة أصبح بالإمكان تحوير النباتات لمختلف الصفات بواسطة Agrobacterium. ولذا تمت دراستها بشكل مفصل وتم تحديد جينوم السلالة A. tumefaciens C58 وتحديد تواليات الجينوم. ويتكون جينوم البكتريا من كروموسوم حلقي وآخر مفتوح وبلازميد Ti وبلازميد آخر كبير. وربما تساعد هذه المعلومات في اعادة تصنيف الجنس مرة ثانية الى انواع وسلالات.

وتستطيع البكتريا ان تنقل قطع DNA الى مدى واسع من الاحياء مثل النباتات وحيدة الفلقة وثنائية الفلقات ومغطاة البذور Angiosperms وعارية البذور Gymnosperms والفطريات والخمائر الكيسية والبازيدية (Basidiomycetes) وسجلت لها القابلية على نقل DNA الى خلايا الإنسان المزروعة.

تعود ضراوة البكتريا لوجود البلازميد الحاث للورم Ti وهو بلازميد يصل حجمه الى 200 – 800 كيلو قاعدة، ويحمل قطعة (Transfer DNA) T – DNA وتوجد مثلها على Ri plasmid والقطعة هي التي تنتقل الى الخلايا النباتية مؤدية الى تحولها الى خلايا ورمية. والشكل (1) ويوضح تركيب البلازميد والقطعة T-DNA.

شكل 1 : تركيب بلازميد الورم Ti – plasmid في البكتريا الزراعية

تدخل البكتريا الى النبات من خلال الجروح الى تصيبها وتقوم النباتات المجروحة بإفراز مواد فينولية كوسيلة للحماية والمواد الفينولية مثل Acetosyringone ومواد اخرى مشابهة تعمل كمواد جاذبة للبكتريا.

وقبل الدخول في التفاصيل الجزيئية لابد من معرفة تأثير البكتريا على النبات وكيفية استغلالها لنقل الجينات، فالبكتريا أصلا ضيقة المضايف ولكن بالتلاعب بتركيبة البلازميد يمكن ان تزداد مضايفها وسعا، واختلاف المضايف يعني عدم وجود مشكلة في انتقال القطعة T-DNA . والبكتريا عند اصابتها لبعض النبات تسبب نخر Necrosis للأنسجة في المنطقة المصابة، وتوجد سلالات تسبب نخر ينتشر ببطيء كما في نباتات الأعناب. وقد يكون النخر سريعا يؤدي الى جعل البكتريا تحث الاستماتة في الخلايا كما في نبات الذرة. ووجد ان هذا النخر يمكن ايقافه باستعمال الجينات الكابحة لمسار الموت مثل الجين P35 من الفيروس العصوي Baculovirus ، ولذلك يمكن ان تخفف هذه الجينات من أعراض الاصابة والزيادة في عيوشية الخلايا النباتية.

تركيب البلازميد Ti :

يحوي البلازميد على منطقة اصل التضاعف ori V ويحوي على القطعة T-DNA وجينات الضراوة ومنطقة تشفر لعمليات الانتقال بالاقتران كما موضح في الشكل أعلاه.

تركيب قطعة T- DNA :

حجمها بين 10 – 30 كيلو قاعدة اي حوالي اقل من 10% من حجم البلازميد، ويحوي البلازميد على قطعة واحدة او مكررات منها T – regions ، وتتكون القطعة من مناطق رئيسة، الوسطية T_c ومنطقة الى اليمين T_R وتحوي جينات لتخليق (mas) Mannopine ومنطقة (ags) لتخليق Agropine . اما الجهة T_L فتحوي جينات الاوكسينات Auxins والسايتوكنينات Cytokmin (منظمات النمو) ocs لتخليق Octopine . وتحاط القطعة بتواليات يصل طولها الى 25 زوج قاعدة وتكون متشابهة تقريبا على الطرفين، وتكون تواليت الجهة اليمنى هي الاهم لأنها تحوي على موقع الانفلاق بالأنزيمات القاطعة.

وتكون معالجة القطعة T- DNA من البلازميد ونقلها الى الخلايا النباتية تحت تأثير جينات الضراوة Vir genes التي يحملها البلازميد وتشمل H , G , F , E , D , C , B , A.

كيفية نقل قطعة T- DNA :

تعمل كل من بروتينات الضراوة virG , virA في التحسس للإشارات وتنظيم الاستجابة الوراثية، virA احد بروتينات الضراوة يوجد في الفسحة المحيطة يتحسس المركبات الفينولية التي ينتجها النبات المجروح، وله فعالية الفسفرة الذاتية وبمساعدة مكونات اخرى مثل انظمة نقل السكريات ChVE وبوجود المركبات الفينولية يقوم بفسفرة virG الذي يكون خاملا بحالته غير المفسفرة، virG المفسفرة يزيد من انتساخ جينات الضراوة الاخرى وذلك لاحتواء ممهداتها على vir box ، اما في الانواع التي لا تستحث فان كل من virG , virA لا تحتاج للحث بالفينولات النباتية.

وتحتاج عملية النقل الى نظام نقل (النوع الرابع IV) المتكون من البروتين virD4 و 11 بروتين من مجموعة virB وعندما تنقل القطعة T – DNA تنقل معها بعض بروتينات الضراوة وهي vir F , virE2 فالبروتين virD4 يعمل كقطعة واصلة لتداخل القطعة مع virD4 (الذي هو انزيم قاطع يقطع القطعة T – DNA من البلازميد) والبروتينات 11 المذكورة تعمل كقنوات للنقل وكذلك تعمل كإنزيمات ATPases لتزويد الطاقة . فمن البروتينات 11 من مجموعة virB مثل virB7 , virB5 , virB2 تعمل تركيب T – pilus الذي يكون بمثابة ممر تمر منه T-DNA وبروتينات الضراوة التي تمر وتنتقل معها، وتكون T- pilus ضرورية لعملية التحول وتتفاعل مع بروتينات على الجدار والغشاء الخلوي للخلايا النباتية، اي ان الشعيرة تعمل على زيادة التصاق الخلايا البكترية مع الخلايا النباتية لتسهيل نقل المواد الوراثية وهذه العملية تكونه حساسة للحرارة وتزداد عند انخفاض الحرارة الى 18 – 20 م لإنجاح عملية الانتقال وتحول الخلايا النباتية الى ورمية.

والحقيقة ان ما ينقل من القطعة هو شريط مفرد T – strand اذ يتلم الشريط بأنزيم القطع virD2 والذي يحوي على تسلسل نووي (Nuclear localization sequence) NLS وينقل المعقد T- complex المكون من T – strand الشريط المفرد و virD2 الذي قام بقطعه وكذلك بروتين virE2 وهو من البروتينات التي ترتبط بأشرطة DNA المفردة (SSB) ويربط معها البروتينات المذكورة اضافة الى بروتينات اخرى. ثم ينقل المعقد من الخلية الى نواتها بتأثير NLS بعد ارتباطه بأحد بروتينات التوريد الى النواة α – importin الذي هو أحد بروتينات نواة الخلية النباتية ويوجد في أنوية الخلايا حقيقية النواة، ويكون الدخول خلال الثقوب الموجودة في الغشاء النووي. ويمكن ان يحدد virD2 اندماج الشريط المفرد ويحدد الموقع المناسب له، ولذلك يكون كل من virD2 و virE2 هي التي توجه المواد الوراثية نظراً لاحتوائها على التوالي NLS.

ويساعد في لف الشريط بروتينات ضراوة اخرى مثل virE2 الذي يتعاون مع الروتين الوصيف virE1 ويساهم البروتين virE2 في حماية قطعة DNA المفردة الشريط من الهضم داخل نواة الخلية النباتية ويقوم بالحماية للمعقد بتغطيته (كما ذكر أعلاه).

وفي داخل نواة الخلية النباتية تنضم بروتينات اخرى لتكوين T-complex . وتشارك في هذه العملية المعقدة بعض الجينات الكروموسومية مثل chvB , ChvA المسئولة عن تخليق السكريات المكوثرة وكذلك الجينات att genes المسئولة عن الالتصاق الخلايا وجينات اخرى تشارك في خطوات مختلفة من العملية.

اقحام T – DNA في جينوم الخلية النباتية

إقحام القطعة في جينوم الخلية النباتية يتأثر بشكل كبير بالهستونات الموجودة والمرتبطة مع الكروموسومات (الميزة الخاصة بالخلايا حقيقة النواة) وخاصة عائلة H2A التي تحوي على 13 جين ولكن منها دور في عملية التحول، فالجين H2A-1 يعبر عنه في الجذور الجانبية والمنطقة المرستيمية ومنطقة الاستطالة، وتعد المنطقة الاخيرة هي الاكثر حساسية للتحول بالـ Agrobacterium ووجد ان هناك علاقة قوية ايجابية بين التعبير عن H2A-1 والتحول بالبكتريا، فزيادة H2A-1 يؤدي الى زيادة أهلية النبات للتحول لذلك يستعمل في تحويل النباتات العصية.

نقل الجينات بواسطة T- DNA

ليس كل قطعة T- DNA على بلازميد الورم تحوي على مواقع فلق بالإنزيمات القاطعة لإدخال الجينات المطلوب نقلها ولذلك لا يمكن استعمالها مباشرة للنقل، وللتغلب على هذه الحالة توجد طرق وتوجهات مختلفة لنقل الجينات المطلوبة الى النباتات ومنها :

• كلونة الجينات بشكل مباشر على البلازميد ووضعها أمام جينات الضراوة لان بعض هذه الجينات يمكن ان تنتقل الى داخل نواة الخلية النباتية.
• استعمال نظام الناقل المنشطر Binary – vector system ويعني وجود اثنين من النواقل احدهما يحمل T- DNA والآخر جينات الضراوة. اي شطر بلازميد الورم وتحميل مكونات المهمة كل على بلازميد صغير اي على متضاعف Replicon مختلف، وهذه المتضاعفات ليس بالضرورة ان تكون بلازميدات فيمكن ان توضع T-DNA على كروموسوم Agrobacterium ويمكن ان تحرك بتأثير البلازميد الحاوي على جينات الضراوة ولكن الافضل استعمال بلازميد واسع المضايف وخاصة من Inc p α – based vector الذي يستطيع ان يتضاعف في E. coli التي يتم عادة تكثير البلازميدات فيها ويستطيع التضاعف في Agrobacterium .

ويستعمل نظام النقل المنشطر نظراً لصعوبة ادخال الجينات بشكل مباشر الى T- region من بلازميد الورم كما ذكر انفا وكذلك صعوبة التعامل مع بلازميد الورم الكبير الحجم، لذلك تفصل جينات الضراوة وقطعة T-DNA. وعند وجود العناصر الوراثية في الخلية الواحدة فان منتجات جينات الضراوة تؤثر على T-region وتعالجها وتنقلها الى الخلية النباتية. والمتضاعف الذي يحمل قطعة T-DNA يسمى بالناقل المنشطر T-DNA binary vector ، اما الاخر الذي يحوي على جينات الضراوة فيسمى بالناقل المساعد Helper vector او vir vector الذي يجب ان يكون من المجموعة غير المتوافقة نفسها التي يعود إليها الناقل الاخر. Vir vector لا يحث الورم لأنه لا يحوي على T- region.

وتحضير النظام المنشطر زاد من استعمال Agrobacterium في نقل الجينات الى النباتات وانتاج نباتات مهندسة وراثيا Transgenic plants . لذلك لان المتضاعفات او البلازميدات تكون صغيرة وتحوي على مواقع انفلاق بإنزيمات القطع كما يمكن زيادة أعدادها في E. coli . وقد طورت النواقل لتحوي على بعض الامكانيات التي تسهل استعمالها لأغراض خاصة منها :

• تحوي على ممهدات ملائمة.
• تحوي على Poly (A).
• ممكن اضافة اشارات Signals التي تسهل ادخال الجينات المرغوب فيها.
• اضافة مشجعات الترجمة Translation enhancers لزيادة التعبير عن الجينات المنقولة.
• تحوي على اشارات لتوجيه البروتينات الناتجة من الجين المدخل في الخلية النباتية، وتكون اعداد نسخها عالية تصل الى 5 – 10 مقارنة باستعمال نسخة واحدة من بلازميد الورم.

وقطعة T – DNA في بلازميد الورم الاصلي تكون كافية لحمل 10 جينات فحجمها في السلالة المهمة C58" تكون في بلازميد الورم pTiC58 حوالي 23 كيلو قاعدة. اضافة الى ان كل من بلازميدات Ti , Ri يمكن ان تحوي مكررات للقطعة لذلك تكون كافية لنقل جينات مسار تخليق كامل وقد أمكن نقل بلازميد الورم البالغ 200 كيلو قاعدة بواسطة عكس ترتيب الجهة اليمنى للقطعة T – DNA

ونقل قطعة كبيرة من DNA يحتاج الى زيادة في التعبير عن البروتينات virG و virE بشكل مستمر وبدون حث لغرض حماية القطعة من التفكك داخل الخلايا النباتية، وهذه الاحتياطات اي زيادة التعبير عن بروتينات الحماية مكنت نقل قطع من DNA بحجم 30 – 150 كيلو قاعدة. ويمكن معالجة الوضع باستعمال طفرات تعبر عن virG و virE بشكل مستمر وبدون حث. ومثل هذه الطفرات استعملت في تحويل نبات الرز وفول الصويا، كما يمكن اضافة نسخ اضافية من virG لزيادة الكفاءة.

ومن جهة ثانية فان عملية نقل الجينات واجراء عملية التحول لا تعتمد على انتاج T- strand وزيادة التعبير عن جينات الضراوة فقط وانما يعتمد على الخلفية الوراثية للنباتات المراد تحويلها.

اندماج T- DNA والتعبير عن الجينات المنقولة :

ليس دائماً يؤدي تحوي النباتات ونقل قطع T- DNA والجينات المحملة عليها الى التعبير عن الجينات المنقولة بكفاءة وذلك يعود الى عدة أسباب منها :

• التأثير الموضعي وهو المكان الذي يدمج فيه الجين المرغوب في جينوم النبات فقد يرتبط في مكان بعيد عن المواقع المشجعة للانتساخ او بعيدا عن المشجعات Enhancers (الموجودة في خلايا حقيقية النواة)
• الجين ممكن ان يندمج في مناطق مؤهلة للانتساخ وبذا يعبر عنه وعليه فان الجين المنقول بدون ممهد يمكن التعبير عنه ولكنه قد يدمج في مناطق صامتة من الجينوم وبذا يكون بدون تأثير.
• استعمال صفة المقاومة للمضادات الحيوية في النباتات لا تساعد في الانتساخ الصحيح لذلك وجب وضعه في مكان نشط من ناحية الانتساخ بواسطة انظمة ادماج موجة متخصصة site - specific integration systems.
• ان اسكات الجين المنقول وعدم حصول عملية التعبير عنه حتى عند استعمال الانظمة المذكور اعلاه ينتج من مثيلة DNA وعملية المثيلة مسجلة ومعروفة في اسكات Silencing عدد من جينات DNA T- . وقد وجد ان عملية الاسكات هذه يمكن ان تحصل في ممهد الجين المنقول وكذلك تحصل بعد عملية الانتساخ اي ان DNA ينتسخ ولكن RNA الناتج يكون غير ثابتة وهذا يحصل بشكل كبير عند نقل عدة نسخ من الجينات داخل الخلية النباتية.

فالتقنيات المستعملة في تحوير الخلايا النباتية مثل التحول الذي يتم بواسطة Polyethylene glycol او التحول باستعمال الأجسام الدهنية وكذلك التثقيب الكهربائي تؤدي الى ادخال عدد كبير من نسخ الجين بشكل مترادف Tandem او بترتيب مقلوب مما يؤدي بالخلية الى اخمادها ولذلك تستعمل البكتريا في نقل نسخة واحدة من الجين.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .