تفاعل سلسلة البوليميرز Polymerase Chain Reaction (PCR)

لقد أستعيضت عملية تضخيم قطع الـDNA معينة أو مورثات معينة التي كانت تجري بربط هذه القطع مع بلازميد أو عاثي ثم مضاعفتها داخل البكتريا بطريقة جدية كلياً وهي تفاعل سلسلة البوليميريز PCR . وأصبح الآن وباستخدام هذه الطريقة تضخيم المورثات إلى ملايين النسخ دون الحاجة إلى إتباع أسلوب الكلونة العام.

يعتمد هذا التفاعل على وجود نسخ مفردة من تردد الـ DNA المراد تضخيمه إضافة إلى بادئة خاصة به وأنزيم بلمرة DNA. يعتبر أنزيم البلمرة Taq من أفضل الأنزيمات المستخدمة في هذه العملية نظراً لقابليته العالية على البلمرة بدرجات حرارة عالية واستقراريته بدرجات الحرارة التي تتراوح بين 94-95˚م المستخدمة في فصل الأشرطة المزدوجة. وأصبح إجراء هذا التفاعل لا يحتاج الكثير من الجهود نظراً لتوفر الإنزيم والبفر إضافة لأنواع مختلفة من البادئات التي تناسب تضخيم عدد كبير من المورثات . والأكثر من ذلك توفر الأجهزة الكهربائية التي تعمل ذاتياً بحيث أن عملية التضخيم لا تحتاج سوى تحضير التفاعل ووضعه في الجهاز بعد برمجته ليعمل بعد ذلك في توفير ظروف التفاعل وفصل الأشرطة المزدوجة.

وأصبحت حساسية هذا التفاعل عالية جداً حيث يمكن إجراءه على نسخة واحدة فقط كقالب . كما يمكن استخدامه لتضخيم قطعة DNA معينة في خلية واحدة كما يحصل في تحديد جنس الجنين أو استخدامه في التضخيم على التحضيرات النسيجية مباشرة.

تضخيم الـDNA بتفاعل PCR:

كما قلنا سابقاً فأن هذا التفاعل يستهدف تضخيم قطعة DNA معينة. لذلك فإن هذا التفاعل يحتاج إلى قالب مفرد من شريط الـ DNA وبادئة معينة إضافة للأنزيم Taq وبفره والنيوكليوتيدات المعروفة dNTP وتوفير ظروف معينة.

يبدأ التفاعل بالتصاق البادئات في النهايات الثالثة والخامسة في الموقع المطلوب تضخيمه ثم بدء عملية بناء نسخ للموقع المطلوب عن طريق إضافة النيوكلوتيدات إلى البادئات وربطها مع بعضها , في نهاية الدورة الأولى من التفاعل فإنه سينتج لدينا أشرطة مزدوجة في الموقع المعين. لذلك فإنه يجري فصل هذه الأشرطة للحصول على أشرطة مفردة مرة أخرى . يتم ذلك عن طريق استخدام درجات حرارية عالية 94-95˚م لفترة محددة يتم بعدها تخفيض درجة الحرارة المناسبة لبدء تفاعل البناء مرة أخرى لإنتاج أشرطة جديدة وهكذا.

وفي كل مرة يتم فيها التفاعل وثم فصل الأشرطة تتضاعف عدد نسخ الموقع حتى الحصول على العدد المطلوب اعتماداً على عدد دورات التفاعل شكل رقم (1) .

شكل رقم (1) تخطيط لدورتين من دورات تفاعل PCR .

تشخيص الأمراض الوراثية بطرق الوراثة الجزيئية :

إن معظم التحليل الوراثي الجاري الآن لتشخيص الأمراض الوراثية لتحديد فرص الإصابة بهذه الأمراض أو تشخيص الحاملين لصفة الأمراض من الآباء يعتمد أساساُ على طرق الوراثة الجزيئية التي أثبتت طرق فعالة ومؤكدة لتحديد هذه الأهداف.

1. استخدام الإنزيمات القاطعة أو المقيدة لتحديد وجود طفرة وراثية أو حذف (RFLPs).
2. استخدام مجسات وراثية خاصة بكل مرض أو تناذر لتحديد وجود عيب وراثي معين.
3. استخدام الطرق المناعية لتحديد بروتين معين مرتبط وجوده أو عدم وجوده بمرض معين.
4. تحديد موقع مورث معين مباشرة على الكروموسومات.

ولأجل توضيح كيفية الاستفادة من هذه الطرق فإننا سنتطرق لأمثلة على استخدام هذه الطرق في التشخيص.

أولاً: استخدام الإنزيمات القاطعة لتحديد طفرة وراثية أو حذفها :

إن التطور التكنولوجي الهائل في مجال علوم الحياة والكيمياء الحيوية ساعد كثيراً في تحديد واستخلاص العديد من المورثات وشمل ذلك الكثير من المورثات أو محاورها المسؤولة عن بعض الأمراض الوراثية.

إن استخلاص هذه المورثات من مجموع المادة الوراثية جعل من السهل على الباحثين وضع خريطة وراثية لهذه المورثات وتحديد مواقع القطع وعددها لكثير من الإنزيمات القاطعة أو المقيدة وهو ما وفر خريطة إنزيمية طبيعية لكل مورث.

إن وجود مثل هذه الخريطة يساعد كثيراً في اكتشاف حالات الطفرة الوراثية أو الحذف أو الزيادة التي يمكن أن تحصل لسبب ما في مورث معين.