التلقيح والإخصاب في أنابيب الاختبار في مزارع الانسجة النباتية

تتكاثر النباتات الزهرية جنسيا بالبذور والتي تتكون كنهاية طبيعية للعديد من العمليات الحيوية ضمن ما يعرف بالتلقيح والإخصاب المزدوج، ويسبق ذلك مجموعة من العمليات المعقدة لتكوين أعضاء التذكير والتأنيث وفى الحالات الطبيعية تنمو حبة اللقاح بمجرد ملامسة الميسم المعد لاستقبالها مكونة الانبوبة اللقاحية التي تمر خلال نسيج الميسم والقلم والمبيض وتصل في النهاية إلى الكيس الجنيني حيث يتم الاندماج الثنائي بين أحد الأنوية المذكرة والخلية الأمية وبذلك يتكون الجنين الزيجوتي ذو التركيب الثنائي المجموعة الكروموسومية. وتتحد النواة الاسبرمية الثانية مع النواتين القطبيتين المتواجدتين في وسط الكيس الجنيني لتكوين الاندوسبرم وبهذا يكون الاندوسبرم ثلاثي المجموعة الكروموسومية. ويعتبر النسيج الاندوسبرمى ذو أهمية كبيرة في إمداد الجنين بما يحتاجه من مغذيات، ويسبب عدم ملائمة الاندوسبرم لتغذية الجنين وإجهاضه.

وتتم هذه السلسلة من العمليات البيولوجية بنجاح عندما يكون هناك توافق بين حبوب اللقاح وبين الميسم. وعلى النقيض من ذلك عندما يتم التلقيح في النباتات التي تتميز بوجود ظاهرة عدم التوافق الذاتي أو بين الأنواع والأجناس غير المتوافقة يثبط نمو الأنبوبة اللقاحية أو تحدث إعاقة فسيولوجية تمنع حدوث الإخصاب بين الخلايا الاسبرمية وبين خلايا الكيس الجنيني. يحدث هذا أيضاً في بعض حالات التهجين المتباعد حيث توجد جينات تسبب عدم التوافق بين نمو أنسجة الأم والجنين وتطور نسيج الاندوسبرم وبهذا يحدث إجهاض للجنين الزيجوتي ولا تتكون البذرة.

ونظرا لحدوث الاخصاب المزدوج داخل الكيس الجنيني الموجود داخل عديد من الأنسجة الجسدية فإن آلية هذا الإخصاب ظلت غير معروفة لوقت طويل. وقد أمكن من خلال التقدم في علم زراعة الأنسجة إجراء عمليات التلقيح والإخصاب باستخدام أعضاء نباتية منزرعة على بيئة غذائية للتغلب على عقبات نمو الأنبوبة اللقاحية وإخصاب البويضات طبيعياً. وقد ساعد ذلك خاصة بعد الحصول على طفرات ذات دور في عمليتي التلقيح والاخصاب لنبات الأرابدوبسس في فهم آلية حدوث الإخصاب المزدوج على المستوى الجزئي (Faure, 2001). بالإضافة إلى ذلك فإن التلقيح المعملي يعتبر طريقة فعالة في الحصول على الأجنة الهجين والتي يصعب الحصول عليها بالطرق التقليدية وقد أورد (2002 ,Razdan) العشرات من المحاولات التي تمت للحصول على هجن بين أجناس مختلفة ومنها بعض الأمثلة الناجحة للحصول على أجنة هجين. وقد مر تطور التلقيح والإخصاب في مزارع الأنسجة بعدة مراحل كما أوردها (1987) , Pierik و (2001) Faure وهي:

1. حاول Boiso في الأربعينيات من القرن الماضي تحقيق هذا الهدف بإزالة القلم من الزهرة ثم وضع حبوب اللقاح على الجزء العلوي من المبيض لكنه لم يتمكن من الحصول على جنين.

2. وفى فترة لاحقة أمكن الحصول على بذور ناضجة بحقن مبيض بعض الأزهار بمعلق خلوي يحوي حبوب اللقاح بعد إزالة أعضاء التذكير أو قبل تفتح المتك وانتشار حبوب اللقاح حيث أمكن التغلب على ظاهرة عدم التوافق والتي تعيق عمليات الإخصاب في بعض نباتات العائلة الصليبية ونظرا لصعوبة اختراق الخلايا الاسبرمية للكيس الجنيني أحيانا تم تطوير هذه الطريقة بحقن الخلايا الاسبرمية في الكيس الجنيني مباشرة.

3. في أوائل التسعينات تقدم أسلوب الإخصاب في أنبوبة الاختبار وأمكن فصل البويضة بمفردها من الكيس الجنيني أو فصلها ملتحمة مع الخلايا المساعدة. وأمكن أيضا فصل الخلايا الاسبرمية من حبوب اللقاح وبزراعة هذه التراكيب الخلوية معا في أنبوبة اختبار وباستخدام بيئة تحتوى على 1-10 مليمول من كلوريد الكالسيوم ورقم هيدروجيني منخفض للعمل على التصاق الجاميطات معاً، وبهذا نجحت أول تجربة لإخصاب الخلايا الجنسية المنفصلة. وبخفض تركيز كلوريد الكالسيوم إلى 100 ميكرومول تفادى (2000) .Antoine et al حدوث اندماج أكثر من أسبرم مع خلية البويضة.

4. وفى نفس العقد تمكن (1991) .Kranz et al من استخدام التيار الكهربائي لدمج الجاميطات المذكرة والمؤنثة لنباتات الذرة، وأعقب ذلك الحصول على نبات ذرة خصب. وتطورت هذه الطريقة بعد ذلك لتشمل عديد من الأنواع. ويستهل ناتج الاندماج الكهربائي أو الكيمائي تكون جدار خلوي خلال دقائق بسيطة من الاندماج لمنع اندماج اسبرمي آخر لتكوين ما يعرف بـ polyspermy.

ويوجد العديد من الطرق التي يتم بها إجراء التلقيح والإخصاب وذلك حسب الهدف وهذه الطرق كما ذكرها (2002) Razdan هي:

1. زراعة البويضات المحمولة على المشيمة في بيئة غذائية ثم إجراء تلقيح مباشر باستخدام حبوب اللقاح عندما تصل الأعضاء المؤنثة إلى مرحلة استقبال حبوب اللقاح وهو ما يعرف بـ in vitro placental pollination وذلك للتغلب على عدم التوافق في Petunia أو لإنتاج نباتات Mimulus luteus أحادية عقب التلقيح بحبوب لقاح من نباتات Torenia fournieri. وقد نجح (1990) .Petolinoet al في الحصول على نباتات ذرة مقاومة للحرارة المرتفعة باستخدام هذه الطريقة على درجة حرارة 38 م بمعنى أن حبوب اللقاح المقاومة للحرارة المرتفعة فقد تمكنت من الإنبات والإخصاب وكانت النباتات الناتجة تحمل هذه الصفة. ونجح استخدام هذه الطريقة في بعض النباتات الذاتية والخلطية التلقيح، لكن تحتاج هذه الطريقة إلى مهارة عالية وخبرة واسعة للحصول على نتائج جيدة.

2. زراعة المبيض كاملا بعد إزالة القلم ويتم التلقيح داخل المبيض باستخدام إبرة دقيقة. وكلما زاد عدد البويضات في المبيض ارتفع معدل نجاح هذه الطريقة، حيث يتيح العدد الكبير الفرصة في وجود عدد من البويضات التي لم تصاب أثناء عزل المبيض. كما يجب أن تتمتع حبوب اللقاح بحيوية عالية وقدرة على الإنبات. وربما تعامل المبايض بمحلول كلوريد الكالسيوم تركيزه 1% قبل يوم من التلقيح لتشجيع نمو أنبوب اللقاح (1970 ,Zenkteler).

3. إذا كان الهدف هو متابعة عملية الإخصاب وتطور الجنين في أنبوبة الاختبار فيجرى فصل وزراعة البويضات في بيئة سائلة قبل الإخصاب الطبيعي ثم التلقيح بحبوب اللقاح. ويعيق وجود غشاء مائي حول البويضة نمو انبوبة اللقاح، ويمكن التخلص منه باستعمال ورق ترشيح وعند نجاح التلقيح يشاهد نمو الأنبوبة اللقاحية في مراحل مبكرة ويتم الإخصاب بين الجاميطات المذكرة والمؤنثة. لكن يصعب متابعة مراحل التطور المبكرة نظرا لصغر حجم حبوب اللقاح وكذلك وجود طبقات عديدة من الأنسجة التي تحيط بالكيس الجنيني فيلزم إعداد عينات في مراحل التطور المختلفة للفحص الميكروسكوبي.

4. ابتكر (1951) Nitsch في بداية الخمسينيات طريقة تعتمد على فصل المبيض من أزهار Cucums و Lycopersicom عقب التلقيح وزراعتها في بيئة مغذية بغرض الحصول على بذور لكنها كانت أصغر حجماً من تلك الطبيعية. وكان لإضافة فيتامين ب ولبن جوز الهند وهرمون IAA تأثير واضح على حجم الثمار والبذور المتكونة في القوارير. وفي بعض النباتات أحادية الفلقة يعتبر وجود الغلاف الزهري من العوامل الضرورية لنمو الجنين والثمار.

5. تمكن (1993) Kranz & Lorz من عزل الجاميطات المذكرة عقب إنبات حبوب اللقاح باستعمال الجهد الأسموزي، وكذلك الجاميطات المؤنثة من داخل الكيس الجنيني والتي تحتوي على خلية البويضة والنواتان المساعدتان ويتم ذلك باستعمال بعض الإنزيمات التي تحلل الجدار الخلوي أو بطريقة ميكانيكية. وتحت المجهر أمكن دمج الجاميطة المذكرة بالمؤنثة بطريقة كهربائية أو باستعمال بعض الكيماويات مثل PEG وبالفعل تكون الزيجوت وانقسم وتكون نبات ذرة خصب. لكن هذه الطريقة معقدة وتحتاج لدقة عالية جدا Bohajawni & Razdan (1996).

حاول العلماء فهم المتطلبات المختلفة والظروف المحيطة والتي تناسب عمليات الإخصاب وتكوين الجنين والبذور في أنابيب الاختبار وركزت هذه الدراسات على المحاصيل الاقتصادية كالذرة والقمح اشتملت هذه الأبحاث على دراسة التركيب الوراثي وحيوية ونوعية حبوب اللقاح وكذلك المراحل التطورية المختلفة للأعضاء المؤنثة وتحديد أفضل الظروف التي تتوافق مع حدوث نجاح التلقيح والإخصاب داخل أنبوبة الاختبار. ويعتبر تركيب البيئة المناسب للمبايض صغيرة العمر من العقبات التي تعيق استخدام هذه الطريقة.

وبالرغم مما حققته هذه الطريقة من نجاح إلا أن هناك بعض العقبات التي تعيق طور الجنين في أنبوبة الاختبار عقب نجاح التلقيح والإخصاب فقد يحدث انقسام ميتوزي للزيجوت وينتج جنين مكوناً من العديد من الخلايا ولكن بعدها يفقد الجنين القدرة على الانقسام والتطور، ويمثل ذلك مشكلة كبيرة حيث يصعب الحصول على النبات الهجين كذلك فإن هناك بعض المشاكل التي ترتبط بانفجار الأنبوبة اللقاحية وفقد الحيوية أو انحلال البيضة وعدم تطور الاندوسبرم. وبصورة عامة بعد حدوث التلقيح في أنبوبة الاختبار يلاحظ زيادة واضحة في حجم المبيض. وقد يكون السبب المباشر في انتفاخ المبيض هو زيادة حجم الاندوسبرم وليس الجنين، ففي بعض الحالات يفشل انقسام الجنين ولكن يستمر الاندوسبرم في الانقسام والزيادة في الحجم ويحدث ذلك في التلقيح والإخصاب بين الأنواع النباتية المتباعدة وراثياً. يدل هذا على أن حدوث الإخصاب ليس أمرا أساسيا في تطور الاندوسبرم فقد يحدث استحثاث لتكوين الاندوسبرم نتيجة لدخول أنبوبة اللقاح إلى الكيس الجنيني. لذا لابد من التأكد من نجاح التلقيح والإخصاب حيث يجري فصل بعض البويضات عقب إجراء التلقيح بفترات متتالية ثم تفحص ميكروسكوبيا وبالتالي يمكن دراسة مراحل تطور الاندوسبرم والجنين (1987 Pieri,) و (Razdan, 2002).

يتم حفظ الأعضاء المؤنثة بعد التلقيح على حرارة 25 : 27 °م وذلك لتنشيط نمو الجنين بعد الإخصاب ولا تحتاج المراحل المبكرة لنمو الجنين إلى مدى محدد من الضوء والحرارة حيث أن الجنين يمكن أن ينمو متصلا بالمشيمة على حرارة الغرفة. أما في المراحل المتقدمة من نمو الجنين فيجب توفير الحرارة المناسبة والملائمة لاستمرار نمو الجنين. وليس هناك فرق في استخدام هذه الطريقة لإجراء تلقيح ذاتي أو تلقيح خلطي لكن عند التلقيح الذاتي نجد أن الجنين يظل متصلا بالمشيمة إلى أن تصل البذرة إلى مرحلة النضج، أما في حالة إجراء التلقيح الخاطئ فيفضل فصل الجنين عن المشيمة بعد 10 أيام من إتمام التلقيح والإخصاب وعند توقف النمو ينقل الجنين إلى بيئة مغذية سائلة. وعندما يصبح الجنين أكثر نضجاً وتطوراً ينقل إلى بيئة صلبة. وفي بعض الحالات أمكن زراعة المبيض كاملا بعد عملية التلقيح والإخصاب وبهذه الطريقة تطورت بعض ثمار الطماطم والخيار في البيئة. وقد احتوت الثمار المتكونة على بذور، إلا أن حجم الثمار كان صغيراً بالمقارنة بحجم الثمار التي تطورت تحت الظروف العادية. وأدى إضافة فيتامين ب إلى البيئة المغذية لتحسين حجم الثمار المتكونة وزيادة حيوية البذور الناتجة. أيضاً اتضح أن إضافة بعض منظمات النمو النباتية مثل IAA او مستخلص لبن جوز الهند يزيد من حجم الثمار.