الفايروسات معادة التشكيل Recombinent Viruse (صور تجهيز مبيدات الحشرات الجينية)

رغم توفر نظم النقل الجيني المعتمدة على الخلايا بدائية النواة، كما في بكتريا Agrobacterium tumefacieus الا ان فايروسات من مجموعة الـ Baculovirus مفضلة على هذه النظم لعدة أسباب اهمها:

1- انها غير ممرضة للفقاريات والنبات.

2- متخصصة في اصابتها للحشرات.

3- هذه الفايروسات لا تستخدم أياً من الخلايا المتحولة أو العناصر الجينية المحولة، كما تفعل الكثير من نظم التعبير الوراثية المأخوذة من اللبائن وبذلك فإن الفايروسات الـ Baculovirus تعد اداة امينة جينياً ولا تحدث أي تغير وراثي غير مرغوب فيه.

4- ان النواتج البروتينية للمعززات Promoters مثل الـPolyhedrin و P10 تكون ذات تأثير تعبيري قوي لعملية ترجمة البروتينات المطلوبة والتي تظهر بسرعة وبكميات كبيرة في الخلايا وتتوفر اليوم ادلة على ان البروتينات السايتوبلازمية والنووية يتم التعبير عنها بمستويات عالية جداً بواسطة فايروسات الـ Baculovirus معادة التشكيل لغاية 200 ملغم / لتر من الخلايا المصابة.

كذلك فإن كلا من الـ Polyhedrine والـ 10 يعدان ضروريان لتضاعف هذه الفايروسات في تقانة زراعة الانسجة، كذلك فإن التعبير الجيني عن الصفة المنقولة يتم في مرحلة متأخرة من دورة الاصابة الفايروسية بما يجعل من المنتجات السامة الخلوية قليلة التأثير على دورة الفايروس التضاعفية.

مما سبق يمكن القول ان فايروسات Baculovirus هي فايروسات مساعدة مستقبلية في عملية الاقحام الجيني Gene Insertion.

عملية اقحام الجين أو الجينات Gene Insertion

ان العديد من الجينات المسؤولة عن انتاج السموم في اللافقريات وكذلك تلك المسؤولة عن الهرمونات العصبية والانزيمات قد تم إقحامها بواسطة تقنيات الهندسة الوراثية في فايروسات الـ (Nucleopolyhedroviruses (NPV. هذه الجينات أو البروتينات القاتلة تمتاز بسرعة تأثيرها وتخصصها على الهدف الذي تعمل عليه أو تؤثر فيه عند تراكيز واطئة جداً قد تصل إلى (10^-12).

ان عملية إنتاج فايرس (NPV) معاد التشكيل يحوي على واحد أو أكثر من الجينات الشفرة المركبات حيوية قاتلة للحشرات، يتطلب اقحام أو إدخال نسخه مصنعه من الجين الغريب والذي قد يكون بشكل شفرة أو كودون Codon معين في بلازميد Plasmid ناقل ان الجين المحمول على البلازميد يتم اتحاده في بكتريا Echerichia coli حيث يتم نسخه في البكتريا بشكل واسع Mass Production بعدها تتم عملية تنقية البلازميد الحامل للجين ومن ثم يتم نقل الجين إلى مجين Genome الـ (NPV) عن طريق اصابة النمط البري لـ DNA الفايرس في خلية حساسة لتعطي الفايروس المتشكل Virus Recombinant الذي يعزل عن الفايروسات غير المتشكلة بطريقة النقش Plaque assays بعدها يتم اكثار الفايرس المتشكل في خلايا يرقات صديقة Premissive تسمح بتكاثره، مثال ذلك خلايا مبايض حشرة Spodoptera frugiperda.

ان عملية استنساخ الجين الغريب أو القاتل خلال عملية تضاعف الفايرس تتم السيطرة عليه بواسطة عامل او مشجع Promoter قد يشتق من الـ (NPV) مثل الـ جين الـ Polyhedrin والـ P10 أو قد يشتق من مصادر اخرى غير الـ (NPV)، كما ان الجين الغريب قد يندمج مع نسخه من تعاقب مشفر لببتيد مفرد Single peptide coding لتسهيل عملية التعبير عن الجين الغريب في الخلية المصابة بالفايروس.

تتوفر اليوم العديد من الجينات التي تم تحديد مواصفاتها في الكائنات الحية المختلفة والمسؤولة عن انتاج السموم والعديد من الهرمونات والانزيمات وغيرها والتي يمكن توظيفها لخفض أعداد الحشرات، ولعل من أهم مجاميع هذه الجينات ما يأتي:

اولا) جينات السموم العصبية Neurotoxic Genes

يعد الجهاز العصبي في الحشرات الأكثر حساسية للسموم وهو هدف جيد للعديد من مجاميع المبيدات الكيميائية التقليدية مثل مبيدات الكلور العضوية والفسفور والكارباميت العضوية وغيرها. وقد اظهرت الدراسات ان السموم العصبية لمفصليات الارجل تشكل مجموعة جيدة من الكيميائيات الفعالة والقوية في مكافحة الحشرات حيث تقوم الكثير من المفترسات الحشرية بشل فريستها الحشرية بسرعة من خلال حقن السم في الجهاز العصبي للفريسة. حيث تعمل هذه السموم على ايقاف نقل الرسائل العصبية في مناطق الاشتباك العصبي أو العمل من خلال تثبيط قنوات تبادل الايونات. إن هذه السموم تكون غير فعالة عند معاملة الحشرات بها سطحياً لذلك فان تحميل جيناتها في الفايروسات العصوية Baculovirus يزيد من فاعلية الفايرس في قتل الحشرة المستهدفة بالمكافحة من جهة ويلعب في نفس الوقت دور الناقل من جهة اخرى ومن اهم الجينات المستخدمة في هذا المجال ما يأتي:

1- جين سم العقرب Scorpion Toxin Gene

وهو سم محاور عصبية متخصص على الحشرات ينتجه العقرب الاسيوي Buthus eupeus حيث تم ادخال الجين الصناعي لهذا السم في مجين الفايرس (AcMNPV) المعروف بـ Autographa Californica Necleopolyhedrovirus بهدف ايقاف تغذية الحشرة وشلها تماماً. نفس العملية تم القيام بها مع الجين الخاص بسم عقرب شمال افريقيا المسمى Androconus austcolis، هذا السم يعمل من خلال ارتباطه مع بروتينات قنوات الصوديوم الموجودة في اغلفة المحاور العصبية مسبباً حدوث تحوير في عملية توصيل ايونات الصوديوم في المحور العصبي محدثاً اثارة في منطقة ما قبل التشابك العصبي الذي يؤدي إلى شل الحشرة وموتها.

2- جين سم الحلم المفترس Predatory Mite Toxin Gene

إن الحلم Pyemotes tritici والمسمى بحلم القش الحكي يفرز سماً يستعمل لشل فرائسه من الحشرات وان هذا السم من القوة بحيث ان انثى الحلم تستطيع ان تشل فريسة يزيد وزنها 17 ألف مرة عن وزن انثى الحلم وهو سم غير متخصص ويحدث الشلل في الفريسة عن طريق تداخله وظائف منطقة الاتصال مع العضلي العصبي.

3- جين سم العنكبوت المفترس Predatory Spider Toxin Gene

إن سموم العناكب هي خليط غير متجانس من مبيدات الحشرات الطبيعية والتي تسبب الشلل في الحشرات، حديثاً تم تحديد الجين المسؤول عن سم جديد أطلق عليه 901 - NPS من العنكبوت المسمى Diguetia canites وعند حقن هذا السم في الحشرات ادى إلى شللها تماماً وهو سم متخصص وعند استعماله مع الـ Baculovirus زاد من فاعلية الفايرس كمبيد للحشرات.

4- جين سم الزنبور المتطفل Parsitic Venom Gene

في دراسة حديثة تم تنقية ودراسة مواصفات السم الذي يحقنه الزنبور المتطفل Bracon hebetor في العائل ويسبب له الشلل وهو سم مؤثر جداً في يرقات حرشفية الاجنحة، ويتوقع الباحثون امكانية استعماله كمبيد للحشرات بعد ادخال الجين المسؤول عن هذا السم في الفايروسات العصوية Baculovirus.

ثانياً) جينات الهرمونات الحشرية - Insects Hormone Gene

تشكل الهرمونات التي يتحكم بها الجهاز العصبي للحشرات Neurohormones أهم الهرمونات المنظمة لنمو الحشرات والعامل الرئيس المتحكم بالعديد من العمليات الفسلجية كعملية الانسلاخ والتحول والتكاثر وغيرها من العمليات، ان نظام الغدد الصماء يقوم بعملية تصنيع الهرمونات وافرازها وتحليلها، كذلك فإن الهرمونات هي مركبات بروتينية غير ثابته وعليه فهي غير ملائمة للتطبيق أو الاستخدام الحقلي لوجود اشعة الشمس والحرارة والكائنات الدقيقة، كذلك فان تناول الحشرات للأجزاء المعاملة بهذه الهرمونات سيعرضها للتحلل داخل القناة الهضمية بفعل الانزيمات المحللة للبروتينات، وعليه فان استخدام فايروسات الحشرات في التعبير عن جينات الهرمونات الحشرية تعد الوسيلة الأكثر كفاءة وعملية في استخدام هذه الهرمونات في مكافحة الحشرات، ومن اهم جينات الهرمونات المستخدمة في هذا المجال ما يأتي:

1- جين هرمون البزوغ Eclosion Hormone Gene

تتميز عملية النمو في الحشرات بوجود سلسلة من الانسلاخات التي تسمح بزيادة الحجم ونمو الحشرة خلال عملية النمو والتحول، ان عملية الانسلاخ في الحشرات هي عملية معقدة تشمل فصل الجليد القديم وتحلله Apolysis ثم عملية افراز الكيوتكل الجديد ونزع الجليد القديم، حيث يعمل هرمون البزوغ على بدء عملية نزع الكيوتكل القديم هذه العملية تتم بواسطة جين هرمون البزوغ، لذلك فقد قام أحد الباحثين بإدخال هذا الجين الذي تم الحصول عليه من دودة التبغ Manduca sexta إلى مجين Genom الفايرس العصوي Autogeopha californica (AcMNP) Baculeopolyhedrovirus nueleopolyheddrovirus. وقد أدت هذه العملية إلى قيام الفايرس بإنتاج كمية عالية من هرمون البزوغ، لذلك فان الباحثين يعتقدون ان ادخال هذا الفايرس إلى جسم الحشرة سيزيد من فاعليته السامة ضد الحشرات نتيجة تكوينه لهرمون البزوغ الذي سيجعل الحشرة في عملية نزع جليد مستمرة، ان الحشرة سوف لا تستطيع تأييض هذا الهرمون والتخلص من تأثيره لأنه ليس مادة غريبة عن جسمها.

2- جين الهرمون المدرر Diuretic Hormone Gene

ان الاتزان المائي في جسم الحشرة تتم السيطرة عليه من خلال عملية التوازن ما بين الكمية المتناولة من الماء والكمية المطروحة خارج الجسم وذلك استجابة للتغيرات التي تحدث في بيئة الحشرة ان الذي يحكم هذه العملية من الناحية الفسلجية هو الهرمون المدرر Diuretic والهرمون المضاد للإدرار Anti-diuretic وقد اظهرت الدراسات ان إدخال الجين المصنع المسؤول عن هذا الهرمون إلى مجين الفايرس العصوي المعزول من دودة الحرير وحقن دودة الحرير ادى إلى تكوين مستوى عالي من الهرمون المدرر الذي ادى إلى خفض حجم الهيموليف في جسم اليرقة بنسبة 30% نتيجة الحقن الذي سببه الهرمون في الاتزان المائي في جسم الحشرة.

ثالثاً) جينات بعض الانزيمات الحشرية Insects Enzyme Genes

من اهم الانزيمات الحشرية التي استخدمت جيناتها لإقحامها في فايروسات الـ Baculo هي: -

1- جين استرير هرمون الصباً Juvenile Hormone Estrase Gene

ان تنظيم عملية التحول Metamorphosis التي تحدث في يرقات وعذارى الحشرات تعد هدفاً جيداً لفعل الفايروسات العصوية المعدلة Recombinant Baculovirus. ان تحول يرقات الحشرات إلى عذارى ومن ثم إلى كاملات عملية يتم تنظيمها بواسطة هرمون الصبا وان انخفاض مستوى هرمون الصبا يؤدي إلى تحول اليرقة إلى العمر اليرقي اللاحق أو التحول إلى عذراء. ان انخفاض مستوى (JH) يكون مرتبطاً عادة بارتفاع مستوى استريز هرمون الشباب (JHE)، وعلى هذا الأساس فقد تم ادخال جين (JHE) إلى مجين Genome فايرس الـ ACMNPV لإنتاج الـ NPV المعدل الذي يحمل جين (JHE) وعند حقن يرقات العمر الاول لدودة اللهانة القياسة Trichophistani بهذا الفايرس فانه ادى إلى خفض نسبة نمو اليرقات بشكل كبير مقارنة بمعاملة المقارنة، كما أدى إلى خفض كفاءتها في التغذية، أما عند حقن يرقات العمر الاخير لنفس الحشرة بنفس الفايرس لم يلاحظ وجود اي تأثير في نمو اليرقات وتغذيتها وقد يرجع ذلك للأسباب الاتية: -

أ) ان مستوى (JHE) في العمر اليرقي الأخير غير قادر على دحر عملية التصنيع الحيوي لهرمون الصباً (JH).

ب) ان انتاج الجين المحول بالفايرس لمادة Ecdysteroid UDP Glucosyl Transferase قد تعمل على خفض أو تقليل تأثير (JHE).

ت) ان الـ JHE كان غير مستقر في جسم اليرقة.

ان عدم فاعلية الجين في الاعمار اليرقية قيد امكانية استعمال هذا الجين كمبيد جيني للحشرات.

2- جین انزيم Ecdysteroid UDP - glucosyltransferase

هذا الجين تم انتاجه بواسطة الـ Baculovirus نوع Autographa californica NPV ACNPV)) حيث يعمل على استمرار التغذية النشطة للحشرة وعدم انسلاخها وعليه فان حذف الجين المسؤول عن الانزيم سيؤدي إلى تسريع عملية موت الحشرة المصابة بالفايرس السالب معاد التشكيل بسبب حذف جين Egt negative virus نتيجة بدء عملية الانسلاخ والتوقف عن التغذية. ففي دراسة على يرقات دودة ورق القطن Spodoptera frugiperda تم عمل عدوى لليرقات بالفايرس منزوع الجين Egt - negative ووجد أن تغذية اليرقات انخفضت بشكل ملحوظ وماتت بسرعة مقارنة باليرقات التي تم اصابتها بالسلالة البرية أو غير معادة التشكيل من الفايرس مما سبق فانه يمكن انتاج مبيدات حشرات من الـBaculovirus معاد التشكيل.

3- جين انزيم الـ Chitinase: -

هذا الانزيم يعمل على تحليل الكايتين خلال عملية الانسلاخ التي تحدث في الحشرات. وعليه فانه يمكن استخدام الجين المسؤول عن هذا الانزيم في إعادة تشكيل فايروسات الـ Baculo التي تصيب الحشرات، في دراسة لحساب نصف الوقت اللازم لموت يرقات العمر الرابع لدودة ورق القطن Spodoptera frugierda المصابة بفايرس معاد التشكيل يحوي جين الـ Chitinase وجد أن نصف الوقت اللازم لموت اليرقات كان اقل بمعدل 20 ساعة عن اليرقات المصابة بالفايرس البري (غير معاد التشكيل) هذه الدراسة اظهرت انه يمكن زيادة النشاط الابادي لمسببات امراض الحشرات Entomopathogens، باستخدام الفايروسات العصوية معادة التشكيل.

رابعاً) جينات السموم المايكروبية Microbial Toxins Genes

ان لمعظم المايكروبات (البكتريا والفطريات) القدرة على انتاج العديد من السموم المؤثرة في الحشرات. والكائنات الاخرى لذلك فان تحديد الجينات المسؤولة عن انتاج هذه السموم يعد الخطوة الأولى في انتاج فايروسات معادة التشكيل تحوي الجينات المسؤولة عن انتاج تلك السموم، ولعل من اهم الجينات المستخدمة في هذا المجال هو:

جين B.T б- endotoxin gene: من المعروف ان البكتريا Bacillus thuringiensis الموجبة لصبغة كرام العصوية الشكل الهوائية تقوم اثناء عملية التبويغ Sporulation بإنتاج اجسام بلورية Crystals تحوي سموم Toxins قاتلة للحشرات، حيث ان وجود هذه السموم في معدة الحشرة يؤدي إلى تكوين فتحات في اغشية خلايا المعدة تؤدي إلى حدوث خلل في التوازن الاسموزي وحدوث تحلل يعرف بالـ Colloid osmotic lysis التحلل الاسموزي الضروري ونضوح محتوى المعدة إلى تجويف الجسم وتتوقف الحشرة عن التغذية ثم الموت.