تعقيم المستأصل النباتي في الزراعة النسيجية

هناك العديد من الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش على أسطح النبات ويمكن أن تتخلل أنسجته عن طريق الفتحات الطبيعية كالثغور (شكل رقم 1) أو الجروح بطبيعة الحال. ويعتبر المُستأصل النباتي من أهم مصادر التلوث في زراعة الأنسجة خاصا إذا كان النبات الأم ينمو في حقل مفتوح ومن ثم يجب أن يعقم سطحياً للتخلص من هذه المسببات المرضية قبل زراعته. ومن حسن الحظ أن العديد من الملوثات السطحية ومنها الخمائر والكثير من أنواع البكتيريا والميكوبلازما يمكن التخلص منها بسهولة في عملية التعقيم السطحي إن لم تكن مغطاة تحت الشعيرات أو الزغب الموجود على السطح، لكن من الصعب التخلص من البكتيريا الموجبة لصبغة جرام بصورة تامة في مزارع الإكثار الدقيق.

شكل 1: يوضح الخلايا البكتيريا العصوية على سطح الورقة وداخل احد الثغور

(http://www.youtube.com/watch?v=ZBcs0hvnXgI)

وأشار (2001) Leifert & Cassells إلى أن تركيز الأملاح ونوعيتها والرقم الهيدروجيني للبيئة من العوامل التي تسبب وقف نشاط العديد من تلك الكائنات. ومن المعروف أن درجة الحرارة في غرف نمو مزارع الأنسجة اقل من 25 م في معظم الحالات. وتلك أقل بكثير من درجة الحرارة المثلى لنمو أغلب الكائنات الدقيقة والتي ربما تزيد في الغالب عن 35° م . وتعتبر هذه المرحلة شدية الأهمية فإن لم يتم الكشف عن هذا التلوث بالطرق المعملية المعروفة في علم الكائنات الدقيقة فسوف يستمر التلوث في الانتقال من مزرعة إلى أخرى، وقد ينشط في إحدى مراحل الإكثار الدقيق بسبب استعمال مكونات نمو وهرمونات مختلفة أو حتى بعد النقل للحقل Leifert & Cassells (2001). ولما كانت تلك الملوثات تحصل على احتياجاتها الغذائية من أنسجة النبات فإن الأنسجة المجروحة والتي تظهر عليها أعراض الشيخوخة أو تلك القريبة من غدد إفراز الرحيق تكون أكثر عرضة للتلوث (1988 Preece)، ويجب تفادى أخذ المُستأصَلات النباتية من هذه الأجزاء أو إتباع طرق التعقيم السطحي التي تضمن خفض هذا التلوث بدرجة عالية مع استعمال بعض المضادات الحيوية للتغلب على الملوثات الداخلية. ويصاحب بقايا الحشرات على الأنسجة النباتية والأسمدة العضوية حمل ميكروبي عالي.

وتتوقف نسبة التلوث على نوع المُستأصل النباتي فالأجزاء الأرضية كالأبصال والريزومات والكورمات أكثر عرضة للتلوث من الأجزاء الخضرية الغير ملامسة للتربة. كما أن لحجم المُستأصل النباتي دوراً في نسبه التلوث، فالقمم الميرستيمية غالباً خالية من معظم الملوثات على العكس من الأجزاء الأكبر حجماً وعموما الأنسجة المسنة يكون التلوث فيها أعلى من الحديثة وقد لاحظ (1988) .Enjalrich et al انخفاض معدل التلوث في القمم النامية لنبات Hevea بالمقارنة مع الأجزاء المسنة. لكن العديد من الكائنات الحية الدقيقة الموجودة خلال المسافات الخلوية قد لا تتأثر بالتعقيم السطحي وتستطيع النمو والانتقال بتقسيم المزرعة. وقد يلاحظ عودة بعض الكائنات الحية الدقيقة للنشاط في المرحلة الرابعة من زراعة الأنسجة حيث تستخدم بيئة ذات تركيز منخفض من الأملاح والسكر. ويوضح (2002) .Sessitsch et al قدرة التعقيم السطحي على التخلص من معظم الفطريات والبكتيريا إلا أن الفيروسات وكذلك الفيرويد تظل موجودة في أنسجة النباتات وتنتقل عبر عملية الإكثار الدقيق في حالة ما إذا كانت النباتات الأم مصابة. كذلك قد تحمل بذور بعض النباتات الفيرويد والبكتيريا والفطريات الداخلية إلا أنه من السهل معرفة التلوث الداخلي للبذور حيث سرعان ما تنبت الجراثيم بمجرد الزراعة في البيئة.

وبالطبع يختلف معدل التلوث الميكروبي باختلاف مكان النمو والمناخ السائد، فالأفرع النامية في جو رطب ودرجة حرارة عالية نسبيا تكون أكثر عرضة للتلوث عن تلك النامية في جو جاف وحرارة منخفضة وبالتالي يتباين التلوث باختلاف فصول السنة (1993 ,George). والمُستأصل النباتي إما أن يكون مصدره نباتات نامية في الحقل أو نباتات نامية في بيوت محمية متحكم في ظروفها الجوية وفى الحالة الأولى تكون هناك فرصة كبيرة للتلوث إلا إذا كانت الأنسجة المستعملة مأخوذة من داخل أنسجة النبات وليس الأجزاء السطحية منه فزراعة أجزاء من جذور الجزر أو درنات البطاطس على سبيل المثال تؤخذ من الجزء الداخلي بعد الغسيل الجيد والتقشير وفي مقارنة لعدد الجراثيم الموجودة على أزهار الطماطم النامية في حقل مفتوح، والبيت المحمي، وغرفة نمو وجد أن هذه الأعداد قبل التعقيم على التوالي هي 1300000، و 85520، و 90 أما بعد التعقيم فكانت الأعداد 922000 ، و 1600، و 43 على الترتيب. أما نسبة التلوث بعد الزراعة فكانت 100، و 60، و 30% على التوالي (1987 Pierik,). وإن كان هناك ضرورة لاستخدام بعض النباتات الخشبية التي تنمو في الحقل تؤخذ الأفرع حديثة التكوين ويراعى ما يلي:

* مقاومة الأمراض الفطرية والبكتيرية الداخلية باستخدام مبيدات جهازية، وقد يترتب على ذلك تأثر المُستأصل المنزرع عقب تأسيس المزرعة Kritzinger et al 1997. وتساعد الرطوبة المنخفضة في جو الصوبة وعدم ابتلال الأوراق بالماء على الحد من التلوث ومن الضروري ترك النباتات ليجف الماء الموجود على السطح قبل أن تعقم وتستعمل للإكثار.

* تؤخذ البراعم بما عليها من أوراق حرشفية بعد انتهاء فترة السكون مباشرة وقبل تفتحها وتحفظ في أكياس بولي إثيلين في درجة حرارة منخفضة (5 °م) حتى لا تجف إذا لم يتم استعمالها مباشرة.

* إذا كانت النباتات في طور السكون يتم التعقيم السطحي للأفرع باستعمال الكحول لمدة خمس ثواني ثم الكلوركس التجاري بتركيز 10 - 20 % لمدة 10 دقائق. توضع قواعد السيقان في محلول 2 % سكر و 200 ملجم/ لتر من 8-hydroxyquinoline citrate وتحفظ على درجة حرارة 23 °م . ويضاف للمحلول السابق 50 ملجم/ لتر من حامض الجبريلك لكسر السكون إذا كانت السيقان جمعت في الخريف وقبل دخول الشتاء (1988 ,Read)، وينصح بقطع حوالي 2 سم من قاعدة الساق بعد يومين لتفادى انسداد الأوعية الناقلة. ثم تستعمل السيقان بعد تفتح ونمو البراعم.

* إن لم تكن النباتات في طور السكون تؤخذ الأفرع قبل بدء تفتح البراعم وتوضع في كأس به ماء في المعمل ويؤخذ النمو الحديث المتكون عقب ذلك.

* للحد من معدل التلوث عند استخدام النباتات النامية في الصوب الزجاجية يجب مراعاة الحفاظ على النباتات من الإصابة بالحشرات كالمن والتربس والعناكب لأنها مصادر لنقل العديد من الأمراض.

هذا وتوضح التجربة التي قام بها (2003) .Watt et al لنقل الأجزاء المنتخبة من أشجار الكافور إلى المعمل لتأسيس المزرعة أن الطرق المختلفة للنقل تؤثر على معدل التلوث الحادث في هذه المرحلة، وبالتالي نجاح المزرعة. وكقاعدة عامة فإن الأجزاء الصلبة كالبذور والثمار يمكن تعقيمها بسهولة وبدون حدوث ضرر أما الأجزاء الغضة كالقمم النامية والبتلات فهي حساسة للتعقيم ويجب أن لا يؤدى التعقيم إلى موتها مع خفض المحتوى الميكروبي إلى أقل حد ممكن قبل نقلها للمعمل. أما الأجزاء الموجودة داخل تراكيب تحميها كالمبايض وهي غالباً خالية من التلوث السطحي، فيمكن تعقيم الأجزاء الخارجية ثم فصل المبايض وزراعتها مباشرة. ولما كانت البذور سهلة التعقيم فإنه يفضل ابتداء زراعة الأنسجة بتعقيم البذور سطحياً ثم زراعتها للحصول على بادرات معقمة تستعمل للزراعة (2002 ,Razdan). ويجب أن تكون المواد المستخدمة في التعقيم السطحي رخيصة الثمن وغير سامة أو منخفضة السمية سواء للإنسان أو النسيج النباتي وذات مدى واسع من التأثير على الميكروبات.

التعقيم السطحي

الهدف منه التخلص من الملوثات السطحية epiphytic دون تلك الموجودة داخل الأنسجة. وقبل التعقيم يجب إزالة أي أجزاء جافة أو بقايا التربة والأتربة ثم يغسل الجزء المستعمل خاصة لو كان من أجزاء أرضية كالجذور والدرنات والريزومات تحت ماء جاري. وفي هذه الحالة يمكن تقشير هذه الأجزاء والتخلص من الأجزاء الخارجية الأكثر عرضة للتلوث. ويلي ذلك غمر المُستأصل النباتي في كحول يتراوح تركيزه بين 70 و 90% على أساس نوع النسيج وذلك لعدة ثوان يعتبر الإيثانول من أكثر الكحولات استعمالا لتعقيم الأنسجة النباتية سطحياً لكن من النادر استعماله بمفرده حيث يتم معاملة الأنسجة بعد غمرها في الكحول بأحد المحاليل المطهرة. ويعمل الكحول بجانب قتله للميكروبات على إزالة الفقاعات الهوائية من على الأنسجة النباتية خاصة في حالة وجود شعيرات أو زغب (شكل رقم 2) يغطى السطح الخارجي وبالتالي يعيق بشدة وصول المحلول إلى كامل السطح، كما يضمن زيادة فاعلية المحلول المعقم. ويشير 1994 Tyman إلى أن مشكلة إكثار نباتات Banksia coccinea تكمن في صعوبة التعقيم السطحي حيث أوضحت صور المجهر الإلكتروني وجود الشعيرات التي تغطى السطح وكثير من الأجسام الغريبة بين تلك الشعيرات. وكانت بعض المعاملات باستخدام المبيدات الفطرية قبل فصل المُستأصل النباتي ونقع الأجزاء النباتية في محلول Benlate لمدة 12 ساعة فعالة في التغلب على هذه المشكلة. وعموما يتراوح زمن معاملة النسيج بالكحول من 30 - 120 ثانية على أساس نوع النسيج فالأنسجة الغضة لا تتطلب سوى 30-60 ثانية أما الأنسجة المتخشبة والبذور فيمكن معاملتها بالكحول حتى 5 دقائق. ويجب ألا تزيد مدة المعاملة بالكحول عن عدة ثواني خاصة في الأنسجة الخضراء حتى لا تموت، يراعى عدم استعمال كحول تركيزه 90% لأنه يذيب الطبقة الشمعية الخارجية وينزع الماء من الأنسجة مما يؤدى إلى موتها، وقد يلاحظ تغير لون الكحول سريعا نتيجة استخلاصه الكلوروفيل بمجرد إضافته وبعد المعاملة بالكحول يتم معاملة النسيج بإحدى المواد المعقمة. ومن أكثر المواد استخداماً لهذا الغرض الصوديوم هيبوكلوريت، ونترات الفضة، وماء البروم، وفوق أكسيد الهيدروجين، وبرمنجانات البوتاسيوم (2004 ,.Ahloowalia et al). لكن من الناحية التطبيقية يتم المعاملة بإحدى الكيماويات الآتية:

شكل 2: الشعيرات التي توجد على سطح بعض الأوراق تعيق وصول محلول التعقيم إلى كامل النسيج (http://www.youtube.com/watch?v=ZBcsOhvnXg).

1 . الصوديوم هيبوكلوريت NaOCl

يعتبر الصوديوم هيبوكلوريت من أكثر المواد استعمالاً في التعقيم السطحي. ويتراوح التركيز المستعمل منه 2-2.5 % وزن حجم على حسب نوع النسيج النباتي وزمن التعقيم. وتستعمل أغلب المعامل محلول التبييض المعروف بالكلوركس والمستخدم في غسيل الملابس لهذا الغرض والتركيز المشار إليه في معظم أبحاث زراعة الأنسجة يتراوح بين 5 و 20% ، لكن يجب التأكد من فاعلية الكلوركس من حيث تركيز الكلور، ويجب عدم استعمال العبوات بعد فتحها بفترة طويلة مع حفظها في الثلاجة حتى لا يتطاير الكلور. ويعمل كل من حامض هيبوكلورس HOCl و OCT وهي الشق الفعال في الكلوركس على قتل الميكروبات بالأكسدة ويعتبر الأول أكثر فاعلية من الثاني. ويفضل أن يكون الرقم الهيدروجيني لمحلول التعقيم 6-7. كما يمكن استعمال هيبوكلوريت الكالسيوم بتركيز 35 - 100 جم التر، مع ترشيح المحلول قبل استعماله. كما يستعمل هيبوكلوريت الكالسيوم المحضر في صورة أقراص بإضافة قرص لكل 100 مل ماء ويفضل استعمال هيبوكلوريت كالسيوم بدلاً من صوديوم هيبوكلوريت في حاله الأنسجة الحساسة للتعقيم لأنه أقل نفاذا في الأنسجة.

2. كلوريد الزئبقيك HgCl

ويطلق عليه محلول سليماني وهو من المحاليل المعقمة لكنه شديد السمية للإنسان وشديد الضرر للأنسجة النباتية إذا زاد تركيزه عن اللازم. ولذا لا ينصح باستعماله إلا في حالة عدم صلاحية المحاليل المعقمة الأخرى. وفي حالة استخدامه لابد أن تغسل الأجزاء المعقمة مرات أكثر بالماء المقطر بالمقارنة مع المحاليل الأخرى حيث أن ترك أي آثار من هذه المحاليل قد يقتل النسيج.

ولزيادة كفاءة محلول التعقيم يفضل إضافة 5-7 نقاط من محلول 20 Tween لكل لتر منه، أو يستعمل بضع نقاط من الصابون السائل إن لم تتوفر المادة الناشرة المشار إليها لخفض التوتر السطحي للمحلول فيزيد التصاقه بالنسيج. كذلك يمكن إجراء التعقيم تحت تفريغ جزئي لضمان طرد فقاعات الهواء التي قد توجد مع الأنسجة المراد تعقيمها. لكن التفريغ الشديد ربما يعمل على دخول المحلول إلى داخل النسيج مما يؤدى إلى موته. ويجب تقليب المحلول والأنسجة باستمرار أثناء التعقيم لضمان التلامس التام. ولمنع دخول المحلول المعقم إلى داخل أوعيه الخشب، يغمس طرف الساق أو أعناق الأوراق على سبيل المثال في شمع سائل قبل إجراء التعقيم مع ملاحظة إزالة هذا الجزء عند الزراعة. ومن الضروري معاملة النسيج بالمحلول المعقم لفترة زمنية مناسبة فزيادتها تسبب ضرر للنسيج ويلاحظ ذلك بتغير لون النسيج إلى الأبيض أو البني، لذا تقطع هذه الأجزاء عند الزراعة.

وكان لسمك الطبقة الشمعية والشعيرات على أسطح نباتات Banksia coccinea دورا في صعوبة التعقيم السطحي، وللتغلب على ذلك قامGodfrey &Cross (2005) بوضع السيقان بعد فصل الأوراق في محلول تركيزه 0.01 مولر من حامض الهيدروكلوريك وبضع قطرات من 80 Tween بحيث كان الرقم الهيدروجيني 2.4 مع الرج لمدة ثلاثة دقائق. وبعد ذلك تم التعقيم السطحي بالصوديوم هيبوكلوريت لمدة 10 دقائق ثم نقلت المُستأصلات إلى محلول معقم من حامض الستريك بتركيز 2.4 مليمول ورقم هيدروجيني 2.9 لمدة 5 دقائق قبل الزراعة. وكان من شأن تلك المعاملات خفض معدل التلوث حيث قل عدد الشعيرات على السطح مع زيادة في نعومة السطح بإزالة الكثير من الزوائد الشمعية والأجسام الغريبة من سطح المُستأصلات.

ويجب أن يؤخذ في الاعتبار تركيز المادة المعقمة وارتباطه بزمن التعقيم حيث يزيد الزمن اللازم للتعقيم عند استعمال تركيز منخفض من المادة المعقمة إذا كان النسيج حساساً للمحلول. وجدير بالذكر أن التركيز العالي ولمدة قصيرة يكون أكثر كفاءة في التعقيم من المحلول المخفف ولمدة طويلة. ولإعطاء فكرة عن تباين زمن التعقيم باختلاف نوع المُستأصل النباتي يوضح (1987) Pierik أن أنسب زمن للتعقيم باستعمال 10% صوديوم هيبوكلوريت هو 45 دقيقة بالنسبة لأوراق نبات Smeltiza regina، أما أوراق Arthurium andreanum وبذور Tulipa generiana فتعقم لمدة 30 دقيقة، والبراعم الزهرية لنباتات الفيرزيا لمدة 20 دقيقة، والأوراق العصارية من Hyacinthus والأعناق الورقية لنبات Gerbera  15 دقيقة، ويقل الزمن إلى 5 دقائق فقط لقمم أفرع نباتات Nephrolepis. ويوضح جدول رقم (1) مقارنة بين بعض مواد التعقيم السطحي المستعملة في زراعة الأنسجة.

جدول 1: مقارنة بين بعض المواد المستخدمة في التعقيم السطحي للأجزاء النباتية المنزرعة (2002 ,Razdan).

* غالباً يستعمل 20% حجم / حجم من المحلول التجاري

ومن الجدير بالذكر الإشارة إلى أن معظم التلوث الحادث في مزارع الأنسجة يرجع إلى وجود أنواع من البكتريا التي لا تمثل مشكلة للنباتات العادية لكنها تنشط تحت ظروف الزراعة المعملية (2001 ,Leifer & Cassells). وكما سبقت الإشارة يلاحظ أن عملية التعقيم السطحي لا تزيل كل التلوث الحادث من الميكروبات المختلفة، لكن لا بد وأن يضمن التعقيم السطحي قتل الغالبية العظمى من الميكروبات السطحية. ويجب التأكد من خلو المزرعة من التلوث في نهاية مرحلة التأسيس، لكن لسوء الحظ ليس هناك طريقة سهلة لمعرفة ما إذا كان النسيج ملوثاً أم لا قبل زراعته. لكن من الممكن تحديد التلوث في فترة وجيزة لا تتجاوز عدة أيام بشق المُستأصل النباتي طولياً إن كان ساق أو جذر وزراعته في عدد من البيئات المحتوية على مستخلص الخميرة أو الببتون والتي تشجع نمو الميكروبات المختلفة مع التحضين على درجة حرارة مرتفعة نسبياً عن تلك الموصى بها في مزارع الأنسجة. ولما كانت النباتات الناتجة من الزراعة المعملية خالية نظرياً من الكائنات الحية الدقيقة فإنه يجب العمل على تنشيط العلاقة التكافلية بين بعض الأنواع النباتية والكائنات الدقيقة مثل Mycorrhiza و Rhizobium عند نقل النباتات إلى الحقل بتلقيح الجذور لضمان النمو الجيد بالحقل.

التلوث الداخلي للمستأصل النباتي

ليس للنباتات جهاز مناعي كالحيوانات يحميها من مهاجمة الميكروبات كما أن عملية التعقيم السطحي تقضى على التلوث الخارجي فقط، أما التلوث الذي ينشأ عن وجود البكتيريا داخل الأنسجة في المسافات البينية بين الخلايا أو داخل الحزم الوعائية فلا يتأثر بهذه المعاملات. ويطلق على هذا النوع من البكتيريا Endophytic وربما يظل التلوث كامناً إلى أن يتم تقسيم المُستأصل النباتي وملامسة الكائنات الدقيقة أو جراثيمها للبيئة. وغالباً يكون التلوث الداخلي راجعاً للبكتريا العصوية التابعة لجنس Bacillus أو من بعض الفطريات الجهازية. ويؤدى وجود الكائنات الدقيقة في المزرعة إلى موتها أو تثبيط النمو كما سجلت بعض التغيرات في قدرة بعض الأنسجة على النمو والتكشف وتكوين أفرع جانبيه. لكن في بعض الحالات لا يسبب وجود بعض أنواع البكتريا داخل النسيج أي مشكلة في زراعة الأنسجة فبكتريا Pseudomonas التي تلوث القمم النامية لنبات الباباظ لا تسبب أي ضرر عند زراعة هذه القمم. لكن بتكرار أخذ أجزاء نباتية منها وزراعتها لمدة 13 مزرعة يحدث بطء في نمو المزرعة (2007 ,.Pious et al) وللتغلب على التلوث الداخلي تزرع القمم النامية دون باقي الأجزاء النباتية لأنها غالباً خالية من التلوث ثم يستخدم النمو الناتج بعدها في الزراعة، أو يتم إضافة بعض المضادات الحيوية إلى بيئة النمو. ونظراً لتخصص المضادات الحيوية يفضل إضافة أكثر من مضاد حيوي واحد للتغلب على الصور المختلفة من التلوث الداخلي ومن حسن الحظ أن التلوث الداخلي ليس شائع في النباتات الناتجة من مزارع الأنسجة ويمكن التغلب على بعضه بسهولة فالقمة النامية لنبات Pelargonium بطول 1مم وليس القمم النامية للأفرع الجانبية خالية من التلوث والذي يوجد غالباً في أسفل الساق وبتكرار أخذ القمة النامية من المزرعة لمدة دورتين يمكن الحصول على نموات خالية من التلوث.

استخدام المضادات الحيوية

يعتبر الموت الموضعي لأطراف أوراق نباتات Limonium cordatum الناتجة من مزارع الأنسجة من المشاكل الشائعة في الإكثار التجاري لهذا النبات والذي يتم باستعمال الأعناق الزهرية كمستأصل نباتي. وقد عزل (2005) .Liu et al عدة أجناس من البكتيريا مثل Pasteurella multocida و Stenotrophomonas maltophilia و Alcaligenes sp من الأعناق الزهرية لهذا النبات. واستطاع التخلص من هذه البكتيريا وبالتالي نمو النباتات طبيعياً في الحقل إما باستعمال نباتات خالية من الإصابة أو باستعمال بعض المضادات الحيوية مثل إضافة augmentin أو cefotaxime أو خليط منهما إلى البيئة المستعملة للإكثار والمضادات الحيوية هي مواد طبيعية تخلق بواسطة الكائنات الدقيقة أو تصنع معملياً ولها القدرة على وقف أو تثبيط نمو ميكروبات أخرى. ونظريا يمكن إزالة التلوث من مزارع الأنسجة بإضافة واحد أو أكثر من المضادات الحيوية حيث يبين (1998) .Keskitalo et al أن القضاء على التلوث الداخلي في المُستأصلات النباتية لنبات Tanacetum vulgare تطلب استعمال أكثر من مضاد حيوي واحد، لكن كان لاستعمال كلا من rifampicin و gentamicin حتى بتركيزات منخفضة تأثير واضح في وقف نمو معظم أنواع التلوث التي عزلت من هذا النبات. بينما ثبط نمو الأنواع التابعة لعائلة Enterobacteriaceae باستعمال cefotaxime وعند استعماله مع gentamicin أمكن تثبيط جميع أنواع البكتيريا تقريباً. لكن يؤكد (1987) Pierik أن استعمال المضادات الحيوية لا يضمن تماما القضاء على التلوث الداخلي فقد يظل كامنا دون أن يلاحظ بالعين المجردة لمدة قد تصل إلى عدة سنوات كما أشار Abreu-Tarazi (2009) .et al في مزرعة للاناناس. ثم ينشط النمو بعد فترة من الزراعة أو عقب نقل النباتات للحقل.

ويمكن بالطرق المعملية أو الجزيئية التحقق من وجود التلوث. فعلى سبيل المثال في حالة استعمال مركب carbenicillin للتخلص من بكتريا Agrobacterium التي تستعمل بهدف نقل الجينات إلى الخلايا في مزارع الأنسجة حيث لوحظ نشاط البكتريا بعد عدة مرات من إعادة الزراعة إن لم يضاف المضاد الحيوي للبيئة. لكن أشار (2008) .Seak et al إلى إمكانية التخلص من التلوث ببكتريا .Xanthomonas sp و Bacillus sp لمستأصلات نباتات Prunus avium بإضافة 200 ملجم/ لتر من cefotaxime sodium لمزارع تكشف الأشطاء مرة واحدة. أما Thomas & Prakash (2004) فقد تمكنا من الحصول على 75% من اشطاء العنب التي تكشفت من زراعة القمم النامية في أنابيب زراعة 150 X 25 مم بإضافة 1 مل من محلول gentamycin أو cefazolin أو خليط منهما بتركيز 50 ملجم / لتر فوق سطح البيئة.

لكن لا بد أن يؤخذ في الاعتبار أن إضافة المضادات الحيوية ليس بديلا عن التعقيم السطحي والاحتياطيات العامة للحد من التلوث. كذلك فإن لبعض المضادات الحيوية تأثير مثبط أو سام على نمو النباتات أو التكشف فعلى سبيل المثال عند تجديد زراعة القمم النامية لنباتات Pelargonium x hederaefolium لعدة سنوات لاحظ (2005) .Wojtania et al حدوث تلوث ببكتيريا Paenibacillus glycanilyticus و Lactobacillus paracasei. وللتغلب على هذا قام باستعمال عدة أنواع من المضادات الحيوية، فوجد أن استعمال كلا من neomycin و streptomycin سببا سمية للنباتات. لكن أمكن تثبيط نمو البكتيريا بدرجة كبيرة مع تكوين أشطاء ذات جودة عالية بعد ثلاث مرات من نقل المزرعة إلى بيئة مضاف إليها carbenicillin بتركيز 500 ملجم/لتر لبيئة. وقد كان لاستعمال cefotaxime بتركيز 250 ملجم/لتر تأثير مشابه لتثبيط نمو البكتيريا لكن سبب تقزم للسيقان واصفرار الأوراق وباستمرار الزراعة في تلك البيئة ماتت النباتات. وتستعمل المضادات الحيوية بصور مختلفة كأن تضاف للبيئة أو يغمس فيها المُستأصل النباتي قبل زراعته، أو رش النباتات الأم قبل أخذ الأنسجة لزراعتها، وأحسن نتائج للحد من التلوث عندما يغمر الجزء المنزرع في المضاد الحيوي وزراعته في بيئة تحتوي عليه. وقد حدد (1987) Pierik الشروط التي يجب توفرها في المضادات الحيوية المستعملة في مزارع الأنسجة فيما يلي:

1. تذوب في الماء.

2. ثابتة وغير متأثرة بالرقم الهيدروجيني أو مكونات البيئة.

3. ليس لها تأثير على مكونات البيئة أو المزرعة.

4. لها مدى واسع من التأثير.

5. قاتلة للميكروب وليست مثبطة لنموها.

6. جهازيه الحركة في عصارة النبات.

7. تضمن طريقة عملها عدم تطوير مناعة الميكروب ضدها.

8. رخيصة الثمن.

لكن من الناحية التطبيقية يصعب إيجاد مركب يفي بكل هذه الشروط فمعظم

المواد المستعملة تكون مثبطة للنمو. ويلاحظ أن معظم هذه المركبات تتكسر بالحرارة ومن ثم يجب تعقيمها بالترشيح خلال مرشحات قطر ثقوبها 0.45 ميكروميتر والتي لا تسمح بمرور الميكروبات ويستقبل المحلول في إناء معقم ثم يضاف للبيئة. ومن المضادات الحيوية المستخدمة في زراعة الأنسجة carbenicillin و ampicillin و streptomycin, penicillen-G chloromycine, cefatoxime kanamycin و rifamyici ويعيق استعمال الكثير منها أثرها الضار على النمو والتكشف كذلك أثرها على الإنسان ويتباين أثر المضادات الحيوية على الأنسجة على حسب النوع النباتي والنسيج فقد لوحظ عدم نمو الأوراق الفلقية والقمم النامية لنبات Brassica juneea عند زراعتها في بيئة تحتوى على 50:20 مليمول من Kanamycin بينما يمكن للبادرات النمو في بيئة تحتوى على تركيز يصل إلى 2000 ميكروجرام. ويرجع التأثير المثبط للمضادات الحيوية إلى تأثيرها على البلاسيتدات والميتاكوندريا وتخليق الكلوروفيل (1988 ,.Weide et al). وقد يؤدى طول مدة زراعة الخلايا في بيئة محتوية على المضادات الحيوية إلى نمو خلايا مقاومة لهذا التركيز من المضادات الحيوية (2001 ,Bhau & Wakhlu) إما عن طريق الطفرات أو بالانتخاب لتلك الجينات المتخصصة بالسيتوبلازم.

ويتباين تأثير المضادات الحيوية على مزارع الأنسجة والذي يتأثر بالطرز الوراثي للنبات. ففي نباتات Tanacetum vulgare على سبيل المثال وجدKeskitalo et al., (1998)  أن سرعة تكشف الأشطاء زادت من 8.3 يوم إلى 19 و 5.20 و 1. 20 يوم عند استعمال gentamicin و rifampicin و cefotaxime على التوالي لوقف التلوث بالمزرعة، وقد زادت هذه المدة بزيادة التركيز. وقد انخفض عدد الأشطاء التي تكشفت خطيا مع زيادة تركيز تلك المركبات الثلاث من 7.8 إلى 2.0، و 2.3 و 2.2 نبات/ مستأصل على التوالي. وقد انخفض طول الأشطاء ومعدل النمو بشدة باستعمال منظمات النمو حيث انخفض معدل النمو من 44.8 إلى 9.5 باستعمال gentamicin. ولم تتكون الأجنة الجسدية في مزارع الباباظ عند استعمال Kanamycin بتركيز 20 - 200 ملجم/ لتر أو geneticin بتركيز 12.5 - 50 ملجم/ لتر (2003 .Yu et al). كما أثرت المضادات الحيوية المستعملة سلبيا على تكوين ونمو الجذور.

لكن أشار البعض إلى تشجيع بعض أنواع المضادات الحيوية للنمو والتكشف في بعض أنواع الأنسجة المنزرعة. لكن لا تزال ميكانيكية هذا التنشيط غير معروفة بشكل تام فقد وجد أن Penicillens وكذلك carbenicillin يؤديان إلى تشجيع نمو خلايا Bouvardia ternifolia لأنهما يحتويان على سلسلة جانبية لها القدرة على تكوين مشتقات لبعض الأوكسينات بالتحلل المائي (1989 ,.Robert et al). ومن الأمثلة الأخرى للتأثير المنشط لبعض المضادات الحيوية في الأنسجة المنزرعة مركب bacitracin الذي أدى إلى تنشيط نمو الكالوس الناتج من نبات Catharanthus roseus وشجع استعمال timentin تكشف الأشطاء من الأوراق الفلقية لبعض أصناف الطماطم (2000 ,.Costa et al). كما أن الجرعات المناسبة من Kanamycin تنشط تكشف بروتوبلاست الدخان لكن التركيز العالي نسبياً يعمل على عدم تخليق الكلوروفيل في الأوراق. كذلك أدى Carbenicillin بتركيز 60 ميكروجرام إلى زيادة عدد الكالوسات التي تكشفت عنها أجنة من نبات الدخان. وقد شجع إضافة Cefatoxime بتركيز 100 ميكروجرام تكوين أجنة جسدية من الزيجوت غير الناضج للقمح. ولا بد أن يوضع في الاعتبار عند استخدام أحد المضادات الحيوية للتحكم في التلوث في مزارع الأنسجة التركيز اللازم لتثبيط التلوث والتأثير السام على النبات، فمثلاً المركب الذي يقتل البكتريا بتركيز 50 ميكروجرام / لتر ويسبب سمية للنبات بتركيز 100 ميكروجرام يستعمل بأمان في زراعة أنسجة هذا النبات. لكن لا يستخدم هذا المركب إذا تساوى التركيز القاتل للبكتيريا مع التركيز السام للنبات.

كثيراً ما تسبب الفطريات الملوثة للأنسجة الداخلية مشكلة في مزارع الأنسجة ورغم إشارة (1984) Shields et al. المبكرة إلى استعمال مضادات الفطريات mycotoxicity في مزارع الأنسجة إلا أن الأبحاث المنشورة في هذا المجال تؤكد أن استعمالها مازال محدودا ومن المركبات التي تستعمل لهذا الغرض المبيد الفطري Benomyl والذي يتكسر أثناء التعقيم، لكن المركب الناتج يكون له تأثير مثبط للفطر وقد يكون له تأثير مشابه للسيتوكينينات (2006 ,West & Preece). ولكي تستعمل مضادات الفطريات في الإكثار الدقيق لا بد وأن تفي بنفس الشروط التي سبق الإشارة إليها في الحديث عن المضادات الحيوية. ومعظم هذه الشروط يتوفر في مركبات (ergosterol biosynthetic inhibitors (EBIs شائعة الاستعمال في الزراعة والطب. ومن بين العديد من المركبات التابعة لهذه المجموعة يرى (1993) .Tyman et al أن مركب miconazole جدير بالدراسة والاستعمال في الإكثار الدقيق نظرا لتأثيره الواسع على العديد من الفطريات وبعض أنواع البكتيريا الموجبة لصبغة جرام، وعدم تأثيره على العديد من النباتات في مزارع الأنسجة. وفى بعض الحالات ينصح برش النباتات في الحقل بأحد مضادات نمو الفطريات مثل Funguran بتركيز 1 جم / لتر Prathanturarug et al. (2007)  أو غمر المُستأصلات في محلول Benomyl بتركيز 2 جم/ لتر لمدة أربع ساعات ثم غسل المُستأصلات بماء عدة مرات قبل التعقيم السطحي التقليدي (2008)Molina -Mederos.

وللتغلب على مشكلة التلوث بالبكتيريا والفطريات والتي وصلت إلى 100% في مرحلة تأسيس مزرعة نباتات Guadua angustifolia قام (2006) .Jimenez et al برش النباتات في الحقل أو البيت المحمي أسبوعيا ولمدة ستة شهور أثناء موسم الأمطار وكل شهر من باقي شهور السنة بمحلول من Kilo L DF-100 بتركيز 5 مل/ لتر و Agri-mycin بتركيز 2 جم / لتر أو Benomyl بنفس التركيز كما استعمل المبيد الحشري Ambush 10 EC بتركيز 1 مل / لتر عند الضرورة. وقبل التعقيم تم غمر العقد الساقية في محلول قلوي 0.05 وزن/ حجم من المبيد الفطري 01 Extran MA لمدة 10 دقائق أو خليط منه مع Agri-mycin و Benomyl بتركيز 2 جم/ لتر لكل منهما لنفس الزمن. ثم تم التعقيم السطحي باستعمال الصوديوم هيبوكلوريت.

وتوضح النتائج المبينة في جدول رقم (2) نجاح هذه المعاملات في خفض معدل التلوث خاصة عند استعمال مستأصلات من البيت المحمي، أما إضافة 2 جم/ لتر من الخليط المعروف بـ (Plant Preservative Mixture (PPM وهو مركب تجارى للتغلب على التلوث في مزارع الأنسجة من إنتاج شركة Plant Cell Technology Washington DC, USA فقد كانت ناجحة لخفض التلوث بشكل فعال. قارنWatt et al (2003)  بين إضافة الكالسيوم هيبوكلوريت أو 0.5-1 جم/لتر من Benomyl إلى بينة الإكثار الدقيق للكافور في مرحلة التأسيس فقط ولمدة أربع أسابيع. وتوضح النتائج المدونة في جدول رقم (3) تأثير استعمال المبيد الفطري أو الكالسيوم هيبوكلوريت في خفض نسبة التلوث وزيادة نسبة تفتح البراعم وعدد الأفرع المتكشفة. لكن لاحظ (2000) Mohamed أن استعمال Benomyl بتركيز 2 جم/ لتر قد سبب ضرر كبير في انبات بذور ونمو بادرات Tagetes erecta.