أسباب التباين الحادث في زراعة الأنسجة

1. النوع النباتي والجزء المستعمل للإكثار

يختلف مدى حدوث التباين في الخلايا والنبيتات الناتجة باختلاف الأنواع النباتية، فبعض الطرز الوراثية مثل Lily و Hyacinth و Ornithogalum وبعض أصناف Saintpaulia تظهر ثباتاً وراثيا في زراعة الأنسجة بدرجة كبيرة حتى أثناء التكاثر بالبراعم العرضية على العكس من بعض الأنواع مثل Freesia و Begonia اللذان يظهران معدلات عالية من الطفرات. وأكثر حالات الثبات الوراثي للكالس وجدت في كالس نخيل الزيت وعندما تستعمل أنسجة نباتية من خلايا ليس بها تضاعف فإن الكالس أو الخلايا الناتجة غالبا ما تكون ثنائية العدد الكروموسومي. ويمكن الحفاظ على هذا المستوى من الثبات لمدة طويلة باستعمال الأنسجة الميرستيمية. ولا يقف معدل التباين على النوع النباتي فقط بل يبين (2000) .Mandal et al في الجدول التالي التباين أن عدد النباتات التي تكشفت ومعدل الطفرات اللونية في أزهار الاراولا عقب المعاملة ببعض الأشعة قد تأثر بدرجة عالية باختلاف المُستأصل النباتي. كما يبين الشكل التالي أن طريقة التكاثر والجزء النباتي المستعمل لهما تأثير على معدل التباين الحادث في زراعة الأنسجة (1993 ,George).

جدول يبين: تأثير استعمال أجزاء نباتية مختلفة على التكشف واستحداث الطفرات في نباتات الأراولا.

يعتقد الكثير أن هناك درجة عالية من الثبات الوراثي لمزارع الأجنة الجسدية بالمقارنة مع تكشف الأعضاء ، لكن هناك الكثير من الدراسات تشير إلى عكس ذلك. لكن يبدو أن الحساسية للتغيرات الوراثية تختلف باختلاف الأصناف والسلالات النباتية، فالكالسات الناتجة من الأنواع المفتوحة التلقيح من Lettuce كانت محتوية على صور مختلفة من التضاعف عن تلك الموجودة في الكالسات الناتجة من النباتات الأم. وبعض النباتات الثنائية مثل Asparagus و Hemerocallis لها قدرة عالية على الاحتفاظ بالعدد الثنائي والقدرة على التكشف حتى بعد فترة طويلة نسبيا من إنتاج الكالس. لكن من غير المعروف كيف يلعب التركيب الوراثي هذا الدور.

شكل يبين: تأثير الجزء المستعمل للإكثار وطريقة الإكثار الدقيق على التباين الحادث في زراعة الأنسجة (1993 ,George).

2. ارتباط مجموعات الميثيل بالحامض النووي DNA-Methylation

حتى وقت قريب لم يكن معروفاً لماذا تحدث التغييرات الوراثية في زراعة الأنسجة. لكن من الثابت الآن أن معظم إن لم يكن كل التغييرات الوراثية المورثة في زراعة الأنسجة ترجع بطريقة مباشرة أو غير مباشرة إلى تغير في عدد مجموعات الميثيل المرتبطة بالحامض النووي وتعمل الميثلة ببساطة على عدم نسخ الجين مما يوقف تعبيره عن نفسه. وهذا التغيير في ميثلة الحامض النووي ربما يرجع كما أشار (1995) .Munksgaardet al إلى:

1. تكوين أو تنشيط بعض الإنزيمات الخاصة بعملية الميثلة.

2. نقص معدل تخليق أو تثبيط الإنزيمات التي تقوم بعكس عملية الميثلة أي نزع مجموعات الميثيل من الحامض النووي.

3. تغيير تركيز المواد أو العوامل المساعدة التي تشارك في هذه التفاعلات. فالتغير في معظم الصفات الكمية بل حتى تنشيط العناصر النقالة والكسور الكروموسومية وتأخير نسخ بعض المناطق في الكروموسومات قد ترجع إلى عملية ميثلة للحامض النووي (1994) .Phillips et al . فإذا كان عدد تلك المجموعات كبير يحدث تثبيط للجين، وبانخفاض عددها يزيد نشاطه. وعلى العموم هناك معدل ونظام طبيعي لارتباط مجاميع المثيل بالحامض النووي ويزيد ارتباط مجموعات المثيل بالأحماض الأمينية الأدينين والسيتوسين في مزارع الأنسجة. لكن ربما لا يتضح تغيير في الطرز المظهري بسبب ذلك وقد سجل بالفعل تغيير في ارتباط مجموعات الميثيل في مزارع أنسجة الذرة والبطاطس والعنب لكن لا يعرف سبب ذلك (2005 ,Jayasankar). وبناء على تلك النظرية فإن زيادة أو نقص مجموعات الميثيل المرتبطة بالحامض النووي يكون سبباً في:

• حدوث الطفرات النوعية في الجينات المتحكمة في جين واحد أو أكثر.

• زيادة نشاط العناصر النقالة التي تكون في حالة ساكنة.

• تحفز التغير في الصفات الكمية.

• تنشيط الطفرات التي تحدث بسبب الكسور الكروموسومية.

إن حدوث كسر في أحد الكروموسومات أو تغير مستوى ارتباط مجموعات الميثيل في أحد المواقع ينتج عنه زيادة ارتباط مجموعات الميثيل بمناطق أخرى وكذلك تنشيط عناصر نقالة أخرى، وبالتالي فإن حدوث تغيرات وراثية يؤدى إلى حدوث المزيد من التغييرات الوراثية الجديدة وبالتالي زيادة معدل التباين. وقد أكد Joyce & Cassells (2002) باستخدام تقنية AFLP تأثير ارتباط مجموعات الميثيل بحامض السيتوزين على حدوث تغييرات ظاهرية في نباتات البطاطس المستولدة من زراعة الأنسجة. وفي معظم الحالات كان هناك ارتباط بين التغيير في الطرز المظهرية والتغير في معدل ارتباط الميثيل بالسيتوزين. كما أن هناك العديد من الدلائل التي تؤكد أن زيادة نشاط العناصر النقالة وارتباط مجموعات الميثيل من الأسباب التي تؤدى إلى انخفاض معدل التكشف بقدم عمر المزرعة. ويمكن القول إن نشاط العناصر النقالة هو السبب في التغييرات الوراثية في الكالسات والخلايا التي تحدث عند الاحتفاظ بالمزرعة لفترة طويلة.

بفرض أن التغير في مستوى ارتباط مجموعات الميثيل بالحامض النووي في الخلية التي تكشف منها النبات هو المسئول عن التغييرات الوراثية فما هو سبب هذا التغير في معدل الارتباط؟ قد يقال إن الظروف غير العادية للزراعة المعملية تؤدى إلى خلل في العمليات الفسيولوجية في الخلايا مسبباً هذا الخلل الوراثي. لكن يبدو أن هذا التصور غير مقنع، حيث لا توجد غالباً تغييرات وراثية في مزارع القمم الميرستيمية ومزارع الأعضاء المنزرعة تحت نفس الظروف البيئية التي تحدث تغييرات وراثية في بعض الأجزاء النباتية الأخرى. لكن من المعروف أن الأوكسين يؤدى إلى زيادة ارتباط مجموعات الميثيل بالحامض النووي، ويحدث ذلك بطريقة عشوائية. وتختلف هذه التغييرات باختلاف نظام الزراعة بل قد يعود بعضها إلى مواد التعقيم السطحية المستعملة لتعقيم النسيج (1993 ,George).

3. الخلل في تضاعف الحامض النووي

يتم تضاعف الحامض النووي للكروموسوم أثناء المرحلة S من دورة انقسام الخلية حيث يتم ابتعاد شريطي الحامض النووي عن بعضهما البعض ثم يتم نسخ كل منهما لعمل نسخة مكملة له. ولا يتم نسخ كل أجزاء الكروموسوم في ذات الوقت فبعض مناطق Heterochromatin والتي يعتقد أنها حاملة وراثياً بمعنى أنها لا تحتوي على جينات فعالة لكنها تلعب دورا في ميكانيكية عمل الكروموسوم يتم نسخها بعد المناطق الأخرى من الحامض النووي وهي التي تحدث فيها الكسور الكروموسومية. وفي زراعة الأنسجة يعتقد أن تضاعف الحامض النووى يتم متأخرا في المرحلة S من دورة الخلية. لذا فإن مناطق Heterochromatin قد لا يحدث لها تضاعف بصورة كاملة قبل انقسام الخلية. وربما يعود ذلك إلى السرعة غير العادية في معدل انقسام الخلايا. وبذلك يحدث الكثير من التغييرات الكروموسومية مثل التضاعف والكسور والتغييرات الوصفية. وفي الثدييات وجد أن زيادة ارتباط مجموعات الميثيل يكون مرتبط بالتأخر في نسخ الحامض النووي وقد تكون هذه الحقيقة صحيحة أيضاً في الأنسجة النباتية (1993 ,George) و (Gaha & George, 2008)

4. نقص بادئات الأحماض النووية

تتطلب عملية الانقسام السريع للخلايا في معظم أنواع مزارع الأنسجة تخليق كمية كبيرة من المواد اللازمة لتخليق الأحماض النووية مثل القواعد النتروجينية، وكذلك العديد من الإنزيمات والبروتينات الضرورية لتضاعف المادة الوراثية. ويؤدى عدم توافر هذه المواد إلى حدوث معدل عالي من الطفرات. وفى بعض التجارب أدت إضافة بعض الأحماض الأمينية كالتربتوفان إلى تقليل معدل الطفرات وثبات الانقسام الخلوي (George, 1993).

5. منظمات النمو

مما لاشك فيه وجود تأثير الظروف البيئية المختلفة خاصة تلك التي تمثل عوامل إجهاد على نشاط الجهاز الوراثي في الخلية. ولما كانت ظروف مزارع الأنسجة نفسها من منظمات نمو وعناصر مغذية بل وحتى المواد المستعملة في التعقيم السطحي تمثل صور مختلفة من عوامل الإجهاد فإنها تقود إلى العديد من التباينات في النباتات المستولدة. وهناك العشرات من الدلائل على ذلك كحدوث تضاعف في نباتات Crepis capillaris الناتجة من زراعة الأنسجة على الرغم من حقيقة الثبات الوراثي لها، كذلك التباين الحادث في النباتات الناتجة من خلية فردية أو في مزارع البروتوبلاست (1996 ,Bhojwani & Razdan). يعتبر نمو الكالسات ومعلق الخلايا صورة غير عادية من النمو ولكي يتحقق هذا الغرض لابد من إضافة تركيزات عالية من منظمات النمو خاصة الأوكسينات. ومن المؤكد أن التركيب الوراثي لعشيرة من الخلايا في الكالس أو المعلق الخلوي يتأثر بتركيز كلا من الأوكسينات والسيتوكينينات المضافين إلى وسط النمو. وغالباً تكون نسبة الخلايا العادية الثابتة وراثياً أعلى في البيئة المحتوية على تركيزات أقل من منظمات النمو أو في حالة عدم وجودها كليا ويتناسب معدل حدوث الطفرات مع وجود كلا النوعين من منظمات النمو.

ولقد أصبح معروفاً أن الأوكسينات من العوامل التي تزيد بشدة معدل حدوث التغييرات الوراثية، لكن تظل آلية هذا التغيير غير معلومة على وجه الدقة، ويعتقد أنها ترجع إلى زيادة معدل انقسام الخلايا التي بها تغييرات وراثية أصلا أو زيادة ارتباط مجموعات الميثيل بالحامض النووي. وعادة يصاحب التركيزات العالية من منظمات النمو تغيير في الطرز المظهري كزيادة التفريع أو استطالة وربما تقزم النباتات لكن لا يورث هذا التباين في معظم الحالات وتختلف الأنواع المختلفة من الأوكسينات في مدى إحداثها تغيرات وراثية في زراعة الأنسجة، ويتوقف ذلك أيضا على النوع النباتي. ويعتبر 2,4-D من أكثر الأوكسينات إحداثا للتغيرات الوراثية كذلك يعمل الكينيتين على استحثاث انقسام الخلايا المتضاعفة. فعلى سبيل المثال وجد أن معدل التغييرات الوراثية في زراعة الأنسجة لنباتات حبة البركة يتلازم مع زيادة تركيز 2,4-D مع ثبات تركيز الكينبتين.

واثبت (1989) .LoSchiavo et al أن معظم حالات الميثلة في خلايا مزارع الجزر ترتبط مباشرة بالتركيز الهرموني حيث قل معدلها عند استعمال الكينيتين زادت باستعمال 2,4-D. وفى الواقع هناك جدل حول تأثير 2,4-D حيث يعتبره البعض سببا في حدوث التضاعف بينما يشير البعض إلى أنه فقط يستحث الخلايا المتضاعفة على الاقسام لاسيما في وجود بعض المركبات الأخرى. وفى استعراض موسع لهذا الموضوع يشير (1996) Bhojwani & Razdan إلى أن استعمال 2,4-D بتركيز مرتفع يصل إلى 20 ملجم/ لتر يزيد من انقسام الخلايا الثنائية أما التركيز المنخفض جداً (0.25 ملجم / لتر) فإنه يزيد من معدل الخلايا المتضاعفة في مزارع خلايا البازلاء. وعموما تزيد السيتوكينينات من معدل انقسام الخلايا في زراعة الأنسجة ، وعند إضافتها بتركيز منخفضة يقل معدل التضاعف في المعلق الخلوي. كما تلعب نسبة الأوكسينات إلى السيتوكينينات دوراً فعالاً في التباين الوراثي. وقد زاد معدل التباين بشدة في نباتات نخيل الزيت الناتجة من مزارع المعلق الخلوي بسبب استعمال الأوكسينات، أما كالسات العنب فقد فقدت قدرتها على التكشف بطول مدة زراعتها في بيئة محتوية على الأوكسينات (Jayasankar, 2005).

6. المكونات الأخرى لبيئة النمو

تعد مكونات البيئة أحد العوامل التي تؤثر على مستوى التضاعف الكروموسومي ونسبة الخلايا المحتوية على اختلافات وراثية. وكلما زاد محتوى البيئة من العناصر المختلفة زاد احتمال حدوث خلل وراثي خاصة حالات التضاعف الكروموسومي أثناء الانقسام. فقد لوحظ في مزارع خلايا الجزر زيادة عدد الخلايا المحتوية على أعداد غير عادية من الكروموسومات بزيادة تركيز الفوسفات في بيئة MS. وزادت نسبة الخلايا الثنائية عندما نقل الكالس إلى نفس البيئة لكن مع خفض تركيز النتروجين إلى الربع. وفي تجربة أخرى زاد معدل الخلايا الأحادية في المعلق الخلوي لنباتات Datura بوجود النتروجين في صورة أمونيا ونترات على العكس من وجوده في صورة عضوية. وقد استردت معظم الخلايا حالتها العادية من التضاعف 30% ثنائي من العدد الكلى عندما نقلت إلى بيئة محتوية على النتروجين في صورة عضوية فقط (1978 ,.Furner et al). والغريب انخفاض قدرة خلايا الجزر على تكوين الأجنة الجسدية في بيئة White بالمقارنة مع وسط .MS وفي مزارع متوك القمح وجد أن عدد الأفراد الألبينو يتأثر بمستوى نترات البوتاسيوم المضافة، وربما يرجع ذلك إلى حدوث فقد في الحامض النووي الموجود بالسيتوبلازم كذلك تؤدى المواد المخلبية مثل EDTA وبعض العناصر الثقيلة إلى زيادة الكسور الكروموسومية. وذلك بسبب الشحنات السالبة الموجودة على أيونات هذه المعادن ومقدرة أيوناتها على تكوين معقد ثابت مع بعض المكونات الأخرى بالخلية ويعتقد أن الزنك هو أكثر هذه الأيونات تأثيرا والكالسيوم أقلها طبقاً لترتيب (1993 George) التالي Zn>Cu>Ni>Co>Fe>Mn>Ca. ويضيف (1990 ,Semal Lepoivre) أن استعمال كلوريد الكالسيوم زاد من معدل التغييرات الكروموسومية في صنف البطاطس 'Bintje'.

7. ظروف المزرعة

يعمل تقصير الفترة الزمنية التي يتم بعدها نقل المزرعة إلى بيئة جديدة كان تكون أسبوعين بدلاً من ثلاثة على الحد من التغييرات الوراثية. كذلك تؤثر طبيعة البيئة على مدى حدوث التباين، ففي مزرعة أنسجة لنبات Hevea لوحظ زيادة معدل التضاعف عند استعمال بيئة سائلة بالمقارنة مع البيئة شبه الصلبة وأمكن الحصول على خلايا ثابتة من الناحية الوراثية في المعلق الخلوي لنبات Hemerocallis spp باستمرار إجراء تصفية للمعلق الخلوي لعزل كتل الخلايا التي تتميز بالنشاط الانقسامي وإعادة زراعتها وأنتجت هذه الخلايا عند تكشفها نباتات ثنائية ومطابقة للنبات الأم. بينما تسبب ترك المعلق دون إجراء تصفية وانتخاب الخلايا الميرستيمية في زيادة معدل التباين الوراثي في النباتات المستولدة (1993 ,George).

يزيد وجود تركيزات عالية من الأكسجين في وسط النمو أو عدم قدرة الخلايا على حفظ نفسها من إثر الأكسدة من حدوث تغيرات وراثية بالخلية. وتلاحظ هذه الظاهرة أثناء عزل وزراعة البروتوبلاست. وعلى العموم لا يتوقف تأثير عوامل بوضوح الأكسدة على عزل وزراعة البروتوبلاست فقط، فقد ثبت أن الجروح التي لابد وأن تحدث أثناء إعداد الجزء النباتي تؤدى إلى تكوين بعض الشوارد الحرة في الخلية مثلalkoxyl radicals, peroxyl ,hydrogen peroxide hydroxyl , superoxide التي لها فعل مؤكسد عالي قد يؤدى إلى حدوث تغيرات وراثية في الخلية إن لم يسبب أحيانا موت الخلية. وقد تضاف بعض مضادات الأكسدة للحد من ذلك. كذلك فإن بعض المواد المستعملة في التعقيم السطحي للجزء النباتي كمركبات الهيبوكلوريت يحفز حدوث الأكسدة. ومن ثم تعمل مضادات الأكسدة كبعض الأحماض العضوية التي تضاف إلى بيئة النمو على الحد من تأثير الشوارد الحرة. كما أن بعض مواد التعقيم السطحية المستعملة تعمل على تكوين بعض الشوارد الحرة free radicals التي تزيد من احتمال حدوث تغيرات وراثية. كما تؤثر درجة الحرارة التي تحفظ عليها المزرعة على درجة الثبات الوراثي لها، حيث وجد (1980) Binns & Meins أن حفظ بعض المزارع على درجة حرارة 35°م يزيد من التضاعف الكروموسومي الثلاثي بالمقارنة مع تلك المحفوظة على 25م. كذلك زاد عدد النباتات البينو في النباتات Lilium longiflorum المستولدة من الأجنة الجسدية للنباتات عند حفظ المزرعة على درجة حرارة 10-15 °م (Jackson & Dale, 1988).

يتناسب معدل حدوث التغييرات الوراثية الجسدية وبصورة خاصة التضاعف الداخلي بدون انقسام النواة والخلية طردياً مع عمر المزرعة فزيادة عمر المزرعة قد يسبب زيادة في معدل الطفرات أو تراكمها، وتقف منظمات النمو ونوع النتروجين وتركيزه والضغط الاسموزي وراء ذلك. ومن ثم يفضل أن يتم تأسيس المزرعة من مستأصل نباتي جديد كل فترة عن استمرار تجديدها من الأنسجة المتحصل عليها في المعمل. وفي معظم الحالات يلاحظ عدم حدوث تباين في النباتات المستولدة عقب تأسيس المزرعة في معظم الحالات التي سجل فيها تباين شديد بين النسل المستولد بعد تجديد المزرعة لعدة مرات في المعمل، قد وجد أن النباتات المستولدة من كالس الدخان الذي تم الاحتفاظ به معمليا لمدة طويلة كانت عقيمة ولم تنتج بذوراً أما النباتات التي تكشفت من كالسات عمرها قصير كان معدل التباين الوراثي بها أقل لكن على العكس من هذه القاعدة يلاحظ وجود معدل عالي من التغييرات في النباتات الناتجة من مزارع البروتوبلاست رغم قصر عمرها. ويمكن إرجاع ذلك إلى تعرض البروتوبلاست لعوامل الأكسدة أثناء العزل والزراعة. قام (1998) .Rodrigues et al بتأسيس مزرعة أنسجة أحد أصناف الموز باستخدام القمم النامية. وقام بتجديد المزرعة عديد من المرات، وحصل من هذه المزارع على عدد 3874 نبات. ولم يسجل أي تباين في النباتات الناتجة حتى التجديد الثالث، ولاحظ بدء ظهور التباينات بعد التجديد الخامس بمعدل 1.3 و 1.3 و 3.8 و 2.9 % بعد التجديد الخامس السابع، التاسع والحادي عشر على التوالي. ويشير (2001) .Jambhale et al إلى الارتباط بين معدل التباين بعد تجديد مزارع الموز 18 مرة وقدرتها على التضاعف.