تم قياس تركيز هرمون البرولاكتين  بإتباع الخطوات المرفقة مع عدة الفحص الخاصة وحسب تعليمات الشركة المصنعة الخاصة بجهاز ELISA  .

  المبدأ العام للاختبار :

إن الاختبار الكمي لهرمون البرولاكتين  مبني على :

Solid phase Enzyme- Linked immuno-sorbent assay ( ELISA)

اذ تم التفاعل بين الأجسام المضادة لهرمون البرولاكتين  في الفأر والموضوعة في الطور الصلب عديم الحركة على أوعية التعيير الصغيرة (Microtiter Wells) والأجسام المضادة لهرمون البرولاكتين في الفئران الموجودة في محلول الارتباط (Horse Radish  Peroxidase) وبناءا على ذلك فانه عند إضافة عينة الاختبار إلى وعاء التعيير فإنها سوف تتفاعل مع الأجسام المضادة اذ تلتف جزيئات هرمون البرولاكتين بين الطور الصلب  Solid phaseوالأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم .

مواد الاختبار :

1- الجسم المضاد لهرمون البرولاكتين في الفئران والمغطي لصفيحة التعيير الصغيرة مع 96 وعاء .

2- كاشف ارتباط الإنزيم .

3- محاليل قياسية standards  والتي تحتوي 0.5 , 15, 50 , 100, 200 ng/mL  , 1 .

4-  كاشف TMB  .

5- محلول الإيقاف  . 1N (HCl)

طريقة العمل : Procedure

1- تم وضع 50µL من عينات الاختبار والمنظمات والمادة الأولية في أوعية التعيير المخصصة لكل منها.

2- تم إضافة  100µL من الكاشف المرتبط بالإنزيم إلى كل وعاء .

3- تمت عملية الرج لمدة 30 ثانية .

4- تمت عملية الحضن في درجة حرارة (18-25°) ولمدة 45 دقيقة .

5- تم إزالة الخليط بوساطة مكونات صفيحة الخفقان إلى وعاء المادة الغريبة .

6- تم غسل أوعية التعيير خمس مرات بالماء المقطر ثم جرى تنشيف الأوعية بورق الامتصاص لإزالة جميع قطرات الماء .

7- تم إضافة  100µL  من كاشف TMB إلى كل وعاء ثم جرت عملية المزج خلال رج الخليط لمدة 10 ثواني .

8- تمت عملية حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 20 دقيقة .

9- تم إيقاف التفاعل بإضافة 100µL من محلول الإيقاف (HCl) لكل وعاء .

10 – تمت عملية المزج لمدة 30 ثانية اذ تغير اللون الأزرق إلى اللون الأصفر بصورة كاملة

11- تم قياس شدة الأمتصاص باستخدام القارئ الخاص بجهازELISA وبطول موجي   450nm.

الحسابات : Calculations

      تم احتساب معدلات قياس الامتصاص الضوئي لكل مجموعة ( العينات ، المنظمات ، المادة القياسية ) ثم جرى رسم منحني قياس بوساطة معدلات الامتصاص التي تم الحصول عليها للمحاليل القياسية من كل قياس مقابل تركيزه على ورقة الرسم الخطية اذ تكون قيم الامتصاص على المحور العمودي أو Y والتركيز على المحور الأفقي أو X  ثم تم بعد ذلك تسقيط القيمة الامتصاصية التي حصلنا عليها من العينات على المنحني لمعرفة تركيز الهرمون وكما هو موضح أدناه ، أن اقل تركيز ممكن لكشف عنه من  هرمون البرولاكتين  في الإنسان بوساطة هذا التحليل قد حدد ليكون     ng/ml .