تفاعل الكوثرة التسلسلي Polymerase chain reaction

تقنية تستعمل لزيادة كمية DNA، اذ تسخن القطع في البداية الى درجة 95م◦ لمسخ DNA وفصل الاشرطة، ثم تضاف قطع البدء التي تكون ضرورية لبناء الاشرطة الجديدة بالاعتماد على اشرطة DNA التي انفصلت في الخطوة الأولى، ويجب ان تكون قطع البدء Primers ملائمة لكلا الشريطين، وتضاف وحدات تخليق DNA وهي النيوكلوتيدات (dTNPs) ويبرد النموذج عند هذه المرحلة ثم يضاف انزيم كوثرة DNA والمستعمل بكثرة Taq المستخلص من الاركيا المحبة للحرارة Thermus aquaticus، وترفع الحرارة الى 72 م◦ ليقوم الانزيم بتكوين الاشرطة المقابلة او المكملة. وتعاد العملية لـ 30 – 40 مرة على مدى 3- 4 ساعات، وبذلك تتكون ملايين القطع، والقطع المضخمة يتم تشخيصها باستعمال الهلام والتصبيغ، او بربط القطع بالبايوتين لكل قطعة بدء وتضاف الى حفر في Microtiter plates مغطاة بـ DNA التي ترتبط الى القطع DNA الناتجة ويتم تحديد البايوتين بإضافة بروتين الافيدين (Avidin) مع انزيم مثل الفوسفيتيز القاعدي الذي يؤدي الى انتاج مركب ملون ثم تضاف مادة الاساس للأنزيم الاخير وتحدد شدة اللون الناتج والخطوات موضحة في الشكل (1).

وتستعمل التقنية في تشخيص الامراض الوراثية وكذلك الناتجة عن الاصابات بأحياء عصية العزل والتنمية مثل Chlamydia و Mb. tuberculosis، وفي حالة البكتريا الاخيرة فعند وجود قطع من DNA في القشع فالتشخيص يمكن ان يتم بسرعة، وكذلك يمكن في حالات اخرى مثل حالة الاسهال يتم البحث عن القطع المشفرة للسم المعوي في الغائط، ولكن نجاح الطريقة محددة بقلة DNA البكتيري او الفيروسي وكثرة DNA غير المستهدف في النماذج.

شكل 1 : خطوات تفاعل PCR

وفي الخلايا حقيقية النواة فان قطع DNA تخلق من mRNA وذلك لان المادة النووية تحوي على قطع الانترونات غير المشفرة في حين ان mRNA يكون معالجا بإزالتها (وحاويا على الاكسونات Exons) ويستعمل في ذلك انزيم النسخ العكسي المستخلص من فيروسات جينومها مكون من RNA.

الخطوة الثانية : اختيار النواقل

النواقل Vectors : وهي الاحتياج المهم الثاني لغرض التغيير الوراثي، وذلك لان قطع DNA المدخلة الى الخلايا المضيفة تتلاشى اذا لم تدمج مع متضاعف مثل كروموسوم الخلية، لذلك تدخل ضمن نواقل او متضاعفات مستقلة، وتعد عملية انتقاء النواقل خطوة مهمة لنجاح علمية التغيير وهناك بعض الاسس التي يتم انتخاب النواقل على ضوئها :

•        ان يكون الناقل مكونا من جزيئة صغيرة لتسهيل تحضيره والتعامل معه.

•        ان يحوي منطقة تضاعف ليكون قادرا على التضاعف بشكل مستقل في الخلايا المضيفة.

•        ان يكون حاويا على أكثر من مواقع للانفلاق بأنزيمات القطع لإدخال القطع المراد ادخالها ويفضل ان تكون ضمن جين اعلان مثل المقاومة للمضادات الحيوية، وعند ادخال القطعة تؤدي الى التعطيل ويسهل الكشف عنها.

•        ان يكون الناقل حاويا على ممهدات خاصة بصفاته، والتي يمكن ان تستعمل من قبل القطع المدخلة في حالة نقلها بدون ممهدات.

وقد امكن تحضير اعداد كبيرة من النواقل والتي أساسها معتمدة على البلازميدات والعاثيات التي تنقل قطع بحجم 10 كيلو قاعدة مع اجراء بعض التحويرات المطلوبة، وحضرت كذلك نواقل مكوكية Shuttle vectors التي يمكن ان تتضاعف في أكثر من خلية مضيفة ليست بينهما علاقة، وفي أغلب الأحيان فان نقطة تضاعف هذه النواقل تشتق من البلازميد pMBI و Co1EI L.

أولا : البلازميدات

وتعد اهم النواقل المستعملة ومنها :

•        البلازميدات pBR322 الموضحة خارطته في الشكل (2).

ويتراوح حجم البلازميد بحدود 4.36  كيلو قاعدة، ويحمل جين مقاومة الامبسيلين amp^r والتتراسكيلين tet^r ، كما يحوي على عدد من مواقع الانفلاق بعدد من الانزيمات القاطعة. ويمكن ان تستعمل صفات المقاومة للتحري لان حشر القطعة المراد نقلها في احد الجينات يعطل صفة المقاومة وبالتالي يتم التحري عنها باستعمال المقاومة للمضاد الاخر.

شكل 2 : خارطة البلازميد pBR322

•        البلازميد pUC18 ، pUC19 من البلازميدات المهمة المستعملة في كلونة الجينات وخارطتها العامة موضحة في الشكل (3).

وتختلف البلازميدات في التوليات التي يمكن ان تنفلق بأنزيمات القطع التي تكون معكوسة الترتيب كما موضح في الشكل. وهي تحوي على قطعة من البلازميد PBR322 وهي EcoRI او PvuI، اضافة الى جين مقاومة الامبسيلين وكذلك تحوي على قطع من اوبرون اللاكتوز مثل LagZ اضافة الى موقع فلق يمكن ادخال العاثي M13.

شكل 3 : البلازميد pUC19 ، pUc18

ثانياً : العاثيات

ويمكن ان تستعمل كنواقل كفوءة في الهندسة الوراثية او تستعمل في تحضير نواقل مهجنة. ومن المعروف ان العاثيات يمكن ان تكون من DNA او RNA. ونظرا لأهمية العاثيات في الهندسة الوراثية فقد تم وضع خرائط القطع لها Restriction maps يمكن ان تستعمل لتشخيص عاثيات من DNA، اذ يعزل الاخير ويعامل بالأنزيمات القاطعة ثم تفصل القطع على اساس الحجم بالترحيل الكهربائي في الهلام وتتناسب حركة الجزيئات عكسيا مع الحجم ويتم الكشف عنها بطرق الاشعاع Radiography او اي طريقة اخرى. وقد امكن باستعمال هذه الطرق رسم الخرائط الطبيعية او الفيزياوية للتمييز بين انواع الفيروسات خاصة التي لا يمكن زرعها. ويمكن تحديد وظائف الجينات (القطع المعزولة) والبروتينات التي تنتجها وتحديد مواقعها، كما يمكن اجراء عمليات التطفير في مواقع محددة من جينوم الفيروس، ويمكن استعمال PCR في رسم الخرائط واجراء عمليات التطفير.

وتكون العاثيات المكونة من اشرطة مزدوجة dsDNA اسهل في عمليات الكلونة وان كانت تحتاج الى خطوات كثيرة. اما العاثيات المكونة من RNA فيستعمل cDNA نظراً لعدم توفر طرق وراثية وكيموحيوية للتعامل معها، كما ان cDNA يعطي نقاوة أكثر ويتجنب التغييرات التي تحصل في جينومات الفيروسات اثناء تضاعفها في مزارع الخلايا. وتوفر الحالة امكانية اكبر لأحداث الطفرات في جينوم الفيروس مثل طفرات الحذف او الطفرات النقطية وتوفر امكانية انتاج طفرات شرطية وهي التي تكون مميتة ولا تستطيع انتاج جزيئات فيروسية قادرة على الاصابة تحت ظروف معينة او ظروف غير متاحة، ولكن مثل هذه الجزيئات قادرة على توليد الاصابة عند ظروف اخرى اي ظروف الاتاحة، ومن أهمها الطفرات الحساسة للحرارة التي تنمو بدرجات حرارية واطئة. وتوفر الطريقة ايجاد طفرات من العاثيات تكون ذات مدى واسع من المضايف، وكل هذه تساعد في رسم الخرائط الكروموسومية وتحديد عملية التضاعف على المستوى الجزيئي.

الفيروسات الناقصة Defective viruses : وهي فيروسات ينقصها جين او أكثر وبذا تفقد بعض الوظائف التي يحتاجها الفيروس للتضاعف ولذلك تستعمل كنواقل جيدة في الهندسة الوراثية مع استعمال فيروسات مساعدة لتساعد في خطوة او أكثر من عمليات التضاعف والنضج. وقد تكون الفيروسات الناقصة فقدت جزءا من جينومها تلقائيا او اثناء التحضير ولكنها تبقى محتفظة ببروتينات القفيصة الطبيعية وهذا يؤدي الى احتفاظها بقابلية الاصابة مثل فيروس التهاب الكبد Hepatitis النوع D : تستعمل الفيروسات في تحضير اللقاحات.

وتوجد أنواع اخرى من الفيروسات التي يمكن استعمالها وهي الفيروسات الكاذبة Pseudoviruses وهي فيروسات ناقصة وتحوي على DNA من الخلية المضيفة بدلا من مادتها الوراثية، وعندها تحيط القفيصة بجزء من جينوم الخلية المضيفة بدلا من الجينوم الفيروسي، وهذه تشبه الفيروسات الطبيعية من الناحية الشكلية المظهرية ولكن لا تستطيع التضاعف ولكن يمكن ان تنقل المواد الوراثية من خلية الى اخرى.

الفيروسات القهقرية المحولة Transformed retroviruses : فيروسات ناقصة استبدل جزء من جينومها بقطعة من DNA الخلية المضيفة التي تشفر لبروتين محول يساعد في التعرف على جينات السرطان، وبعضها لا يستطيع التضاعف ويحتاج الى فيروسات مساعدة لأجراء عملية التضاعف.

 ويمكن ان تحصل للفيروسات العائدة الى العائلة او المجموعة نفسها عند وجودها في الخلية المضيف الواحدة اذ تتداخل مع بعضها منتجة افراد جديدة لا تشبه اي من الأبويين، وقد يكون التداخل وراثي اي تداخل الحوامض النووية وتكون الابناء لا تشبه الاباء، او يكون التداخل لا وراثي وتكون الافراد الناتجة تشابه الآباء وراثيا. وعمليات التداخل الوراثي تتم بعملية التأشب، والطريقة التقليدية حدوث كسور في اشرطة الحوامض النووية ويرتبط جزء من جينوم احد الاباء مع جزء من جينوم الاب الثاني. والفيروسات الناتجة تكون ثابتة وتعطي أحفاد مشابه لها عند التضاعف. وتختلف الفيروسات في مدى حدوث التأشب فيها.

وفي الفيروسات التي تكون جينوماتها مقسمة مثل فيروس الانفلونزا فان الافراد الجديدة تنتج من اعادة ترتيب الجينوم نفسه وليس حدوث تبادل قطع الجينوم وهي الاكثر سهولة والاكثر حدوثا.

وأي من الفيروسات المذكورة اعلاه هندست لتعمل كنواقل تضاعف وتعبير عن الجينات الفيروسية والخلوية، ويمكن لأي فيروس ان يستعمل ناقلا اذ احتوى على معلومات التضاعف والسيطرة على الانتساخ واشارات التعبئة. وتقنيات انتاج النواقل الفيروسية تعتمد على جينومات الفيروسات من نوع DNA  (كما ذكر آنفا) ومنها الفيروسات التي تصيب الحيوانات، ولكن نظام مزاياه الحسنة ومساؤه.

العاثي لمدا (λ) : من العاثيات المهمة المستعملة نواقلا في الهندسة الوراثية. والعاثي يمكن ان يؤدي الى تحلل الخلايا او الاستقرار في حالة استذابة. ويتكون العاثي من رأس متعدد الأوجه يحوي على جينوم العاثي ويحاط بغلاف بروتيني وذنب يساعده على الالتصاق الى الخلايا الحساسة له وحقن الجينوم. ويتكون جينوم العاثي من 49 كيلو قاعدة تتوزع في مناطق منها 40% اي حوالي 20 كيلو قاعدة غير ضرورية للعاثي ويمكن ان تستبدل بـ DNA غريب، اما الباقي فتتجمع على شكل عناقيد وتمثل 60% وتكون ضرورية لفعاليات حث الاصابة، ويتكون الذراع الأيسر من 20 كيلو قاعدة وتشمل الجينات المسئولة عن تكوين الرأس والذنب وتحمل الرموز من A – J ، اما الذراع الايمن فيتكون من 10 كيلو قاعدة وتضم مواقع الالتصاق عندما يكون العاثي بتركيب حلقي. ومواقع الالتصاق (Cos) Cohesive sites  تمتد الى مسافة 12 قاعدة وتكون على طرفي الجينوم وتكمل احدها الاخرى، وهذه النهايات اللزجة تساعد العاثي على تكوين التركيب الحلقي وتؤثر في عمليات تضاعف وتكاثر العاثي كما تساعده للاندماج مع كروموسوم الخلية التي يصيبها. وعند دخول العاثي الى داخل الخلية فانه يدخل طور الاستذابة والاندماج مع كروموسوم الخلية عندما تساعد الظروف على التعبير عن البروتين C1 الذي يكبح الجينات العاملة في دورة التحلل. او يتم تحفيز Cro وانتاج البروتين Cro الذي يؤدي الى تحفيز تضاعف العاثي وتعبئته وبالتالي انفجار الخلية كما موضح في الشكل (4).

ويستعمل العاثي في تحضير انواع من النواقل منها :

1-      نواقل الاقحام Insertion vectors وفيها ازيلت المناطق غير المهمة واستبدلت بالمواد المراد نقلها.

2-      نواقل الاستبدال Replacement vectors وفيها يحوي الناقل على موقعين للانفلاق بالأنزيمات حول المنطقة غير الضرورية والتي يمكن ان تستبدل بقطعة DNA المراد نقلها.

ويستعمل العاثي ومشتقاته لكلونة الجينات التي تكون واتجها سامة او مؤذية للخلايا، وعند اختيار الناقل من مجموعة العاثي لمدا فانه يجب الاخذ بنظر الاعتبار حجم القطعة المراد نقلها وذلك لأنه لا يوجد ناقل من مشتقات العاثي ملائما لكلونة قطع DNA من مصادر مختلفة.

شكل 4 : حالة الاستذابة والدورة التحليلية للعاثي λ

وتتعثر عملية الاصابة بالعاثي فيما اذا عبأ بزيادة من المواد الوراثية تصل الى 105%، كما انها تتعثر عند حذف بعض جينومه ليكون 80% من الحجم الأصلي.

العاثيات الخيطية Filamentous phages

وأهم هذه المجموعة المستعملة نواقلا في الهندسة الوراثية هو M13 الذي يتكون جينومه من 6.4 كيلو قاعدة. والعاثي مكون من أشرطة مفردة من ssDNA معبأ في قفيصة بسيطة التركيب تتكون من مكررات لثلاثة بروتينات وبذلك فهي تحتاج الى 3 جينات، ويكون شكله خيطي كما موضح في الشكل (5).

شكل 5 : تركيب ودورة تضاعف العاثي الخيطي M13

يرتبط العاثي بالشعيرة الجنسية على سطح الخلية ثم يدخل الجينوم الحلقي مفرد الاشرطة ويعمل كقالب لتكوين جزيئة DNA ثنائية الاشرطة تعرف بالعمل المتضاعف Replicative factor (Rf) والاخير يستعمل كقالب للتضاعف لعدة دورات وكذلك للتعبير عن الجينات المسئولة عن تكوين بروتينات القفيصة. وعندما تتجمع حوالي 100 – 200 نسخة من العامل المتضاعف يقوم العاثي بحث بروتينات تمنع الاشرطة الجديدة من التحول الى عمال متضاعف مزدوج الاشرطة، وتعبأ الموجودة في القفيصات كما موضح في الشكل.

وبما انه من الصعوبة التعامل مع اشرطة DNA المفردة لذلك تستعمل العوامل المتضاعفة مزدوجة الاشرطة لإدخال قطع  DNA المزدوجة المرغوبة، ويمكن تنقية العوامل المتضاعفة الحاوية على الجينات المراد نقلها من الخلايا المصابة، وتنقل الى الخلايا المؤهلة بعملية التحول وتبدأ بالتضاعف مثل البلازميدات. وقد اشتقت من العاثي نواقل مهمة هي M13 mp بعد اقحام قطع صغيرة من الجين المنظم لاوبرون اللاكتوز من E. coli للمساعدة في الكشف عن الخلايا التي دخل العاثي إليها، كما انها تحتوي على العديد من مواقع الانفلاق بالأنزيمات كما موضح في الشكل (6).

الشكل (6) : تركيب احد عاثيات M13mp المحورة

ولذلك يكون العاثي المحور ملائما للعديد من عمليات الكلونة اذ ان حجمه مثالي كناقل اضافة الى احتواءه على واسمات تسهل عملية تتبعه، كذلك وجود مواقع الفلق التي تستعمل لا دخال قطع DNA .

ثالثاً : النواقل المشتقة

وتشمل المجموعة عدد من النواقل التي اشتقت من العاثيات والبلازميدات او تم تصنيعها لتلاؤم أغراض خاصة ومنها :

1-      الكوزميدات Cosmids : نواقل هجينة من البلازميدات والعاثيات. والاساس فيها البلازميد الذي يحوي على أصل التضاعف من Co1EI وجين المقاومة الذي يحمله اضافة الى تواليات الالتصاق Cos من العاثي لمدا وتكون لازمة لتعبئة DNA الكوزميد المتاشب في رأس العاثي. ومن صفات هذه النواقل انه في الخلية البكتيرية يتضاعف كبلازميد، وتستعمل لنقل قطع كبيرة من DNA تصل الى 35 – 45 كيلو قاعدة، لذلك تكون ملائمة لنقل جينات الخلايا حقيقية النواة كقطعة واحدة. ومن الكوزميدات المستعملة لنقل جينات حقيقيات النواة الكوزميد c2XB و pJB8، والأخيرة موضحة خارطته في الشكل (7).

ويصل حجم الكوزميد 5.4 كيلو قاعدة ويحوي اصل التضاعف Co1EI ويحوي على منطقة واحدة من Cos اضافة الى جين مقاومة الامبسيلين ومواقع انفلاق مختلفة كما موضح في الشكل، وتصل سعته لكلونة قطع مكونة من 33 – 46.5 كيلو قاعدة.

شكل 7 : خارطة الكوزميد pJB8 المستعمل في نقل جينات الخلايا حقيقية النواة

2-      الفاجميدات Phagmids : نواقل هجينة من البلازميدات والعاثيات تحتوي نقطة أصل للتضاعف من عاثي خيطي. فمثلا الفاجميد pRS314 يحضر من العاثي M13 لانتاج نسخة صغيرة من الفيروس الذي حجمه حوالي 4.78 كيلو قاعدة, ولذلك فانه يكون نسخ متعددة من اشرطة مفردة.

 ويختلف الفاجميد عن الكوزميد الذي يمكن ان يدخل الخلايا بكفاءة، فالعاثي المستعمل في تحضير الفاجميد لا يمكن ان يدخل الخلايا، وكذلك لا يستطيع ان يتضاعف نظراً لإزالة كمية كبيرة من مواده الوراثي واستبدالها بالمواد المراد نقلها الا اذا استعمل مع بعض العاثيات المساعدة مثل f 1 اما ما تبقى من الفعاليات مثل تخليق بروتينات القفيصة فهي لا تزال موجودة. وبعد التضاعف فان الناقل يعبأ في رأس العاثي.

تستعمل الفاجميدات لتنظيم وتكثير قطع من DNA الخاصة التي تدخل الى نواقل مصممة من البلازميدات والعاثيات والكوزميدات وغيرها. ومن الفاجميدات المهمة التي صممت لتعمل في عدة مضايف من البكتريا السالبة لصبغة كرام، الفاجميد P1pBHR – T وهو فاجميد صغير يتكون من 7283 زوج قواعد وتركيبه موضح في الشكل (8).

شكل 8 : تركيب الفاجميد P1pBHR – T المستعملة في هندسة البكتريا المعوية

وهو يتكون أساسا من العاثي P1 الذي يستعمل لانتاج العديد من البكتريا المتشأبة وذلك لقابليته على نقل الواسمات الكروموسومية وكذلك واسمات بلازميدية مثلا من البلازميدات F و R ، والعاثي يمكن ان يصيب عددا من سلالات E. Coli اضافة الى عدد كبير من انواع البكتريا السالبة لصبغة كرام تصل الى 25 نوع. وانتشاره الواسع هذا ناتج من قابليات او وظائف مضادة للتقطيع عند دخوله الخلايا، فالعاثي نادرا ما يتعرض للتقطيع عندما يصيب خلايا تحوي على إنزيمات القطع مـــن الصنف الأول، وهذه المقاومة تعود الـــــــــــى وجود بروتينات خاصة DarB) Defense against restriction proteins و DarA) الموجودة في رأس العاثي.

استعمل العاثي مع البلازميد pBR322 الواسع المضايف ويشارك البلازميد في التشفير لبروتينات التحريك mob ويحوي نقطة التضاعف Rep والمقاومة للكانامايسن او الامبيسيلين Kan^r / amp^r  ، اما مشاركة العاثي فتكون بـ pac المسئولة عن تعبئة المكونات في رأس العاثي وكذلك مسئولة عن التضاعف التحللي Lytic replication ، ويحوي على نقطة لأنهاء الانتساخ وهي مشتقة من α –operon من E. coli، اضافة الى وجود مواقع فلق بأنزيمات القطع. والناقل يتضاعف بشكل معتدل، ويمكن الفاجميد مشابه للبلازميد الذي اشتق منه وكذلك يتوافق مع البلازميدات الاخرى ولذلك يستعمل لإصابة السلالات التي تحوي على البلازميدات الطبيعية المقيمة في الخلايا. كما يمكن تحميله بقطع تصل الى 100 – 115 كيلو قاعدة، وهذه الصفة مهمة لأنها تسهل نقل الجينات الكبيرة او المجموعة من الجينات التي تشفر لمكونات تعمل في مسار ايضي معين او مسار لنقل الاشارات Signal transduction pathway كاملا. وتتم حماية DNA المنقول بواسطة بروتينات الحماية Dar A و DarB التي يحملها العاثي لذلك فان مثل هذه النواقل تكون ملائمة لتصميم سلالات تحوي على جينات تعبر عن البروتينات المتباينة Heterologous proteins .

3– نواقل التعبير Expression vectors : في كثير من النواقل هناك أساسيات وعدد من السيطرات الواجب توفرها ومنها وجود جين ممهد يحوي على بداية الانتساخ mRNA اضافة الى موقع لارتباط mRNA على الرايبوزوم لبدء عملية الترجمة Ribosome binding site (rbs)، ونظرا لان القطع المراد نقلها في بعض الأحيان لا تحتوي على مثل هذه الضروريات او تفقد اثناء التحضير ولذلك تربط على نواقل تعبير بسيطة الموضحة في الشكل (9)

شكل 9 : التركيب الاساسي لنواقل التعبير

والممهدات المستعملة قد تكون قوية لانتاج كميات كبيرة من النسخ او ضعيفة لانتاج نسخ قليلة وبالتالي كميات من البروتينات المعتمدة عليها والتي بدورها تعتمد على الغرض التي حضر من اجلها الناقل. ومن الممهدات المستعملة هي ممهدات او برون اللاكتوز Lac او اوبرون التربتوفان Trp او استعمال هجين منهما tac، ومن الممهدات القوية المستعملة هي تلك المشتقة من العاثي لمدا.

ومن هذه النواقل صممت نواقل Cassette وذلك بأحداث تغييرات في مواقع الفلق بالإنزيمات، ويمكن اجراء اي تغييرات اخرى.

4-      الفوزميدات Fosmids : نواقل وراثية تشابه الكوزميدات ولكن البلازميد المستعمل هو بلازميد الخصوبة F – plasmid. ويكون استعماله في الكلونة محددا نظراً لآنه يستعمل في E. coli كمضيف له، والخلايا يمكن ان تحوي فوزميد واحد فقط. والفوزميدات تكون أعداد نسخ واطئة مما يضفي عليها الثباتية مقارنة بالكوزميدات التي تكون عدد كبير من النسخ، استخدمت هذه النواقل وساعدت في برامج تحديد توالي الجينوم البشري. والشكل (10) يوضح تركيب احد هذه النواقل.

شكل 10 : تركيب احد الفوزميدات الخاصة بالبكتريا السالبة لصبغة كرام

نواقل الفطريات والخمائر : نظراً لأهمية هذه المجموعة في العمليات التصنيعية الحيوية الانتاجية فقد طورت العديد من النواقل لتحسين مواصفاتها.

فالخمائر مثل خميرة الخبز تحوي على البلازميد µm2 الذي يتراوح حجمه حوالي 6 كيلو قاعدة وهو ملائم جدا للعمل كنواقل كلونة واستعمال في تحضير بعض النواقل المهمة في هذه المجموعة من الاحياء، ويحمل جين تخليق الحوامض الاميني الليوسين ويمكن ان يتضاعف في الخلية لينتج حوالي 200 نسخة، وقد استغلت صفة تخليق الليوسين كواسمة وراثية ملائمة لان مقاومة المضادات الحيوية تعد واسمات غير ملائمة في الخمائر. ومن هذه النواقل :

1-      (YEP) Yeast episomal plasmid الذي حضر من البلازميد 2µm والبلازميد البكتيري pBR322 وبحجم يقرب من 12.7 كيلو قاعدة والموضح تركيبه في الشكل (11).

ويستطيع الناقل الاندماج مع كروموسوم الخلية نظراً لوجود تشابه في المناطق المشفرة للحامض الليوسين. والناقل الاخر المشابه له هو (YIP) Yeast integrated plasmid مشتق من البلازميـــــــــــد pBR322 وبعض مكونات جينوم الخميرة الخاصـــــــــة بتخليق الليوسين. والناقل plasmid (YRP) Yeast replicative  وهو أيضاً مشتق من البلازميد pBR322 والجين المسؤول عن تخليق الحامض الاميني التربتوفان، ويستطيع الاندماج مع جينوم الخلايا في المناطق المشفرة للتربتوفان.

ويستخدم البلازميد 2µm في بناء نواقل في الخمائر الاخرى وكذلك الفطريات المهمة من النواحي الصناعية.

شكل 11 : نواقل الخمائر (YEP)

نواقل القطع الكبيرة : وهي تمثل انواع مختلفة من النواقل تستعمل لنقل قطع DNA الكبيرة التي لا تستوعبها النواقل المذكورة أعلاه وهي تمثل نواقل صناعية ومنها :

أ‌-        كروموسومات البكتريا الصناعية (BACs) Bacterial artificial chromosomes  من نواقل الاقحام يمكن ان تساعد في نقل قطع تصل الى 300 كيلو قاعدة. وحضرت النواقل من عدة أجزاء ضرورية مثل نقاط أصل التضاعف التي يمكن ان تشتق من البلازميد f1 او تشتق من عاثيات البكتريا مثل P1.

ب‌-      كروموسومات الخمائر الصناعية (YACs) Yeast artificial chromosomes ويمكن ان تنقل قطع تصل الى 1 ميكا قاعدة، لذلك تستعمل لنقل جينات الإنسان، وساهمت في مشروع تحديد تواليات الجينوم البشري.

ج- كروموسومات اللبائن الصناعية (MACs) Mammalian artificial chromosomes : وهذه تخص عمليات الكلونة في اللبائن وتستطيع نقل قطع 1000 كيلو قاعدة على الاقل، وتحتاج النواقل الى احتياجات خاصة تلاؤم خلايا اللبائن مثل وجود جسيم مركزي Centromere وكذلك وجود أطراف الكروموسومات Telomeres وتستعمل لدراسة الجينات ووظائفها وطرق تنظيمها.

نواقل الخلايا حقيقية النواة الراقية : هذه النواقل تستعمل لتحويل خلايا اللبائن والنباتات. وتكون النواقل حاوية عناصر تنظيم وهي الممهدات التي يمكن ان تضاف لها المشجعات Enhancers التي توضع بجنب الممهد لزيادة انتساخه. وتحوي على اشارات لعملية انهاء كفؤة، وكذلك آليات لتحوير النسخ بعد ترجمتها مثل عملية اضافة الادنين Polyadenylation ، وبعض الأحيان ربط بعض التواليات من الانترون وقد هندست العديد من الفيروسات لنقل الجينات بين الخلايا سواء من انواع التي تمون مادتها الوراثية من DNA مثل SV40 وكذلك الفيروسات الغدية وفيروسات الهربس Herpes ومجموعة فيروسات شلل الاطفال والفيروسات القهقرية.

الخطوة الثالثة:

بعد الانتهاء من تحضير قطع DNA المراد نقلها وايجاد نواقل الكلونة الملائمة تربط القطع الى النواقل بعد تحويرها مثل ازالة مجموعة الفوسفات لمنع عودة ارتباطها مع بعضها، وهناك العديد من الانزيمات العاملة في هذه الخطوة والخطوات التي بعدها والموضح بعضها في الجدول (5) ومنها :

•        E. coli DNAP I لإضافة النيوكلوتيدات، وله فعالية القطع الخارجية بالاتجاه من 5' الى 3' وكذلك له فعالية القطع بالاتجاه المعاكس.

•        قطعة Klenow جزء من انزيم كوثرة (DNAP) DNA في البكتريا اعلاه، تقوم القطعة أيضاً بإضافة النيوكلوتيدات، ولها فعالية القطع الخارجي بالاتجاه من '3 الى '5 فقط.

•        الفوسفيتيز القاعدي من أمعاء العجول، يساعد في إزالة مجموعة الفوسفات من الحوامض النووية.

•        الانزيم اللاحم Ligase من العاثي T4 يربط النهاية الفوسفاتية '5 الى النهاية الهيدروكسيلية '3

•        انزيم كوثرة من العاثي T4 النيوكلوتيدات وله فعالية القطع الخارجي بالاتجاه من '3 الى '5  فقط.

•        انزيم النسخ العكسي يعمل لانتاج DNA من أشرطة RNA

•        انزيمات الكاينزات وتكون من مصادر مختلفة تعمل على تحريك ونقل مجاميع الفوسفات.

•        انزيمات النقل مثل Terminal deoxynucleotidyl transferase لإضافة النيوكلوتيدات الى النهاية 'OH من DNA.

•        EoxIII لتفكيك أشرطة DNA المفردة و RNA عند النهايات '3  و '5.

•        SI nuclease لتفكيك اشرطة DNA المفردة و RNA عند الثلمات والفجوات Gaps.

•        Mung bean nuclease لتفكيك اشرطة DNA المفردة و RNA عند Gaps.

•        DNAase لتفكي أشرطة DNA المزدوجة بوجود ايونات المغنيسيوم في مناطق عشوائية ولتفكيك اشرطة DNA المزدوجة بوجود ايونات المنغنيز في المناطق نفسها.

•        انزيمات القطع الخارجي من العاثي لمدا لتفكيك DNA عند النهاية 5' وتكون قدرته لتفكيك الاشرطة المزدوجة أكثر بـ 100 بقدر فعاليته لتفكيك الاشرطة المفردة

ويتم عادة تحضير قطع DNA ومعاملة النواقل بالأنزيم نفسه كي يكون هناك تلاؤم في النهايات الناتجة مثل توليد النهايات اللزجة التي تسهل عملية الربط. وعند قطع البلازميدات التي تكون بمثابة حلقات شديدة الالتفاف تتحول الى تراكيب مفتوحة متراخية، ثم تربط بقطع DNA الحاوية على مجاميع الفوسفات بالأنزيمات اللاحمة وبالتالي يتم الحصول على الناقل او البلازميد المتأشب Chimeric plasmids وبتركيب ملتف جدا (Covalently closed circular). ويجب ان يكون البلازميد بشكل حلقة كي يستطيع التضاعف في الخلايا المضيفة وهي E. coli في المراحل الوسطية ثم يتم انتخاب الخلايا التي التقطت الجين المطلوب. والخطوط العامة للعملية موضحة في الشكل (12).

فبعد ربط القطع بالناقل تنتج نواقل هجينة يتم ادخالها الى الخلايا المضيفة اما بطريق التحول او التنبيغ بالعاثي او اي طريقة اخرى ملائمة (المارة الذكر)، وفي حالة عدم ملائمتها يمكن استعمال طريقة التثقيب الكهربائي Electroporation وفي هذه الطريقة يمكن نقل الجينات الى احياء مختلفة، اذ تخلط الخلايا مع قطع DNA ثم تعرض الخلايا لمجالات كهربائية عالية الفولتية لمدة وجيزة جدا مما يؤدي الى اضطراب الطبقات الخارجية من الجدران والاغشية الخلوية فاسحة المجال امام قطع DNA بالدخول ثم تعود الى حالتها الطبيعية. ويمكن ان تجرى على الخلايا الطبيعية او الجبيلات Protoplasts او Spheroplasts . او تستعمل طريقة القذف الحيوي Biolistic وفيه تخلط المواد الوراثية مع جسيمات صغيرة من فلز ويستعمل التنكستن او الذهب، وتكون هذه الجسيمات بقطر اصغر من 1 مايكرومتر وتقذف بوسائل خاصة مثل مدفع الجزيئات Particle gun الذي يتصل بأنبوبة بقطر 0.22 مايكرومتر لحمل الجزيئات، ثم تحقن بسرعة كبيرة لتدخل الى داخل الخلية. ويمكن تطبيقها مع كل الخلايا او مع العضيات مثل المايتوكوندريا، وتستعمل للخلايا والانسجة لذلك يمكن ان تستعمل لعلاج خلايا الإنسان الجسمية بالجينات ضمن ما يعرف بالعلاج الجيني Gene therapy.

شكل 12 : الخطوط العريضة لكلونة الجينات

وعمليات التثقيب الكهربائي والقصف الحيوي وان كانت ملائمة للأغلبية العظمى من الخلايا والتي ساعدت في فهم التعقيدات وفشل طرق التوصيل الاخرى، ولكن هذه الطرق لها ما يعيق استعمالها منها انها تحتاج الى جهد كبير ووقت طويل وكذلك صعوبة اعادة التجارب بنتائج متطابقة. كما ان الطرق تحتاج الى دراسة ووضع الظروف المثلى لكل سلالة يراد تحويلها واستعادة الجدران الخلوية في حالة استعمال خلايا منزوعة الجدران (الجبيلات) وقد وجد ان عملية تثقيب الخلايا الكاملة تكون متغيرة بشكل كبير وتعتمد على عدد من الظروف منها :

•        الوسط المستعمل لتنمية الخلايا.

•        طور النمو الذي تكون فيه الخلايا عند استعمالها.

•        تركيز الخلايا النهائي للنموذج المستعمل.

•        مكونات وتركيبة وسط التثقيب.

•        المؤشرات الكهربائية.

•        الظروف المستعملة لانتخاب الخلايا المحولة.

فعند استعمال النواقل المشتقة من الفيروسات مثل الكوزميدات فتدخل الخلايا بعملية التنبيغ والتي تستعمل في نقل جينات اللبائن الموضحة خطوطها العريضة في الشكل (13)

شكل 13 : كلونة جينات اللبائن باستعمال الكوزميدات

اما عندما يراد نقل قطعة كبيرة من جينوم اللبائن او الإنسان فتستعمل YAC والخطوات موضحة في الشكل (14)

شكل 14 : نقل القطع الكبيرة او الجينات البشرية بواسطة كروموسومات الخمائر الصناعية YAC

ومن الخلايا المستعملة كمضايف لتسلم قطع DNA المهجنة او النواقل المهجنة هي خلايا بدائية النواة وبشكل خاص E. coli ، اما من الاحياء حقيقية النواة فتستعمل الخمائر بشكل رئيس وان كان ممكنا استعمال الخلايا الحيوانية والنباتية وذلك يعتمد على عدد من الأمور مثل صلاحية اشارات الانتساخ في الخلية المضيفة وقابلية تحوير البروتينات بعد الترجمة وغيرها. ويمكن ان تمرر النواقل في أكثر من مضيف خاصة عند استعمال النواقل المكوكية. ثم بعد تكثير النواقل يمكن ان تعاد الى الخلايا الاصلية او الى خلايا اخرى منتجة.

الخطوة الرابعة:

الكشف عن الخلية المكلونة، وتعد الخطوة الاخيرة في عمليات الكلونة، وهناك عدة طرق للكشف عن الخلايا التي التقطت الجين المطلوب. وكما مر ذكره ان أغلب النواقل تحمل صفة مميزة لها مثل مقاومة المضادات الحيوية او الطرفات العوز الغذائي Auxotroph. وهذه الصفات يمكن ان تستعمل بشكل مباشر في التحري كما يمكن استعمال الأجسام المضادة وحيدة النسيلة Monoclonal antibodies التي ترتبط بخاتمة واحدة Epitope لتحديد الخلايا او النسيلة Clone وهي الافراد الناتجة من خلية واحدة التقطت الجين من مجموع الخلايا، ويمكن استعمال الطرق الكيماوية المشعة وذلك باستعمال نيوكلوتيدات تحوي الفسفور المشع 32P التي تدمج مع DNA بفعالية الانزيم DNAP. وهذه الطريقة غير مفضلة لقصر العمر النصفي للفوسفور المشع او المعلم، وهي حوالي اسبوعين اضافة الى خطر الاشعاع المرافق لاستعمالها. ويمكن استعمال طرق تهجين الحوامض النووية للكشف عن الجين الملتقط فيما اذا توفرت مسابر (Probes) DNA او RNA ملائمة. كما ان الجين الذي ادخل في مكان بحيث لا يؤثر على تضاعف الناقل، فالأخير يمكن تضخيمه او تضخيم نواتجه ثم تنقى وتدرس، كما يمكن اجراء تحوير في الجين المنقول ومقارنته بخارطة القطع له اذا كانت متوفرة.

تحليل DNA المكلونة : وتعد الطريقة مهمة للكشف عن قطع DNA المكلونة وتستعمل فيها مسابر DNA. وهذه المسابر DNA probes تستعمل في دراسة تواليات الحوامض الامينية في البروتينات الناتجة بشكل غير مباشر وتحضر المسابر من استعمال cDNA المشفر له بـ mRNA والتي تستعمل لتحديد التواليات في الجين المكلون.

وهناك عدة طرق مثل :

•        استعمال تهجين DNA للـ RNA بواسطة Northern blots التي يمكن ان تعطي معلومات حول الكميات المختلفة في RNA.

•        يمكن تحضير تواليات معينة من DNA بواسطة انزيمات القطع تفصل على الهلام وتهجن مع DNA الناتج من الكلونة باستعمال Southern blots . وكلونة القطع تمكن من عزل المناطق المحيطة بـ DNA بطريقة تعرف Chromosome walking .

•        اما طريقة Western blot والمستعملة بكثرة فهي تعتمد على الأجسام المضادة لتحديد الجين المكلون بارتباط الأجسام المضادة الى البروتينات الناتجة من الجين المكلون.

وتستعمل مسابر DNA بكثرة في عمليات التحليل وخاصة في الطب الشرعي والكشف عن العيوب الوراثية في جينوم الإنسان والتي تستعمل في الاستشارات الوراثية. كما أنها تستعمل في الكشف عن الاحياء ذات المتطلبات الكثيرة Fastidious في النماذج السريرية التي يصعب تنميتها، وتستعمل في تشخيص العوامل المرضية بسرعة ومباشرة في الانسجة. وتوجد مجسات لعدد من الاحياء المرضية صعبة الزراعة مثل Mb. tuberculosis و Chlamydia trachomatis .

واستعمال المسابر لها بعض المتطلبات مثل المسابر نفسها وطريقة اعطاء الاشارات وكذلك نوعية اهداف DNA التي تحضر المسابر لها وظروف التهجين التي تستعمل اثناء تطبيق استعمال المسابر. فالمسابر الكبيرة تعطي نتائج أكثر صحة وذلك لانها اقل حساسية للتغيير بنيوكلوتيد واحد في DNA المستهدف، في حين ان المسابر الصغيرة تكون سريعة الاستجابة وحساسة جدا ويمكن ان تصمم لمناطق محددة وثابتة من DNA والتي لم يتم احلال اي قاعدة غريبة فيها. وتربط عملية استعمال المسابر مع تقنية PCR التي تستغل لتضخيم قطع DNA التي تهجن مع المسابر وهي طريقة افضل من استخدام المسابر مباشرة. وتربط المسابر بجزيئة اعلان مثل بعض الانزيمات التي تعطي ألوان محددة ويمكن قياسها.

المصادر

الخفاجي , زهرة محمود (2008) . التقنية الحيوية الميكروبية (توجهات جزيئية ) . معهد الهندسة الوراثية والتقنية الحيوية . جامعة بغداد .