العوامل المؤثرة على النمو والتكشف في مزارع الأنسجة (العوامل المتعلقة بالظروف البيئية للمزرعة)

يقصد بالظروف البيئية في هذا الصدد الظروف التي يتم فيها تحضين المُستأصل النباتي والمزرعة الناتجة منه. فعلى الرغم من وجود المزرعة في وعاء مقفل يعزل البيئة الداخلية إلى حد ما عن الخارجية، فإن التحكم في البيئة الخارجية يحور مكونات الداخلية. وفى حالة تكشف نباتات فإن الأجزاء الخضرية منها والموجودة فوق سطح البيئة تكون أكثر تأثراً بالبيئة الخارجية عن الجذور والتي تتأثر بدرجة عالية بالبيئة الداخلية أي الوسط المغذى. ومن ثم فإن التحكم في البيئة الخارجية يكون له تأثير مباشر وسريع على الأجزاء الخضرية أما التأثير على المجموع الجذري فيكون بطئ وغير مباشر في معظم الحالات ويتوقف مدى تأثر الظروف الداخلية بالظروف الخارجية على درجة التبادل الغازي بينهما. وهناك العديد من المقالات المرجعية حول هذا الموضوع منها .(2007) .Mehrotra et al . و . Kozai et al(1997) ويمكن حصر الظروف البيئية التي تؤثر في زراعة الأنسجة في العوامل التالية:

1. طبيعة البيئة

تستعمل البيئة المغذية في صورة سائلة أو في صورة شبة صلبة كما هو متبع في العديد من مزارع الأنسجة. وأحد أسباب تأثير طبيعة البيئة على زراعة الأنسجة هو وجود ذلك الغشاء الرقيق من الماء الذي يحيط بالمُستأصل النباتي ويلتصق به وهو ما يسمى بـ Nearest layer والذي قد يكون عقبة في طريق انتشار المواد المختلفة من وإلى المُستأصلا لنباتي. ويعتمد سمك هذا الغلاف على طبيعة البيئة، ففي البيئة السية الصلبة يكون سميكاً بالمقارنة مع الحالة السائلة، ويقل هذا السمك أيضاً اعتمادا على قوة رج البيئة. وعلى الرغم من ذلك فإن استعمال البيئة شبة الصلبة سائد في مزارع الأنسجة لأنه يحقق المميزات التالية:

أ. إمكانية رؤية الأجزاء الصغيرة والتعامل معها.

ب. احتفاظ المُستأصل النباتي باتجاه ثابت أثناء الزراعة وبالتالي نمو الأفرع المتكشفة باتجاه طبيعي عكس الوسط السائل المتحرك حيث تفشل الأفرع في النمو الطبيعي.

ج. عدم الحاجة إلى وسيلة للتهوية التي قد تكون صعبة التنفيذ أو مرتفعة التكاليف.

اما عيوب استعمال البيئات الصلبة والتي تعتبر من مميزات استعمال الوسط السائل فهي:

أ. ضرورة تقسيم أو نقل المزرعة كل فترة تتراوح بين 4 و 6 وأسابيع مما يزيد من تكاليف الإنتاج حيث أن ذلك يتطلب عمالة تقدر بنحو 40-60% من تكاليف الإنتاج.

ب. المواد السامة المفروزة من المُستأصل النباتي لا تنتشر بسرعة إلى البيئة وبالتالي تتراكم في النسيج.

ج. التصاق الأجار بجذور النبيتات الناتجة يمثل عقبة في عمليات الأقلمة والزراعة خارج المعمل لذا يجب التخلص منه وقد يضر ذلك بالجذور المتكونة.

د. صعوبة استعمال الأجار في الأنظمة الميكانيكية فإنه قد يحتوي على مواد مثبطة للنمو أو التكشف أو على الأقل تؤثر على سرعة التكشف.

هـ. صعوبة إزالة البيئة من الأوعية المستخدمة للزراعة والتي يستعمل عددا كبيرا منها فيؤدى ذلك إلى زيادة التكاليف.

ويمكن في بداية تأسيس المزرعة أي في المرحلة الأولى استعمال بيئة شبة صلبة ثم تنقل المزرعة في المرحلة الثانية من الإكثار إلى بيئة سائلة للعمل على زيادة تكوين البراعم العرضية ثم تنقل بعدها إلى بيئة صلبة في المرحلة الثالثة لتشجيع تكوين الجذور على الأشطاء. لكن تتوقف إمكانية إتباع هذا الأسلوب على النوع النباتي. وقد استعمل (1997) .Riek et al نظام آخر لإكثار الورد يعرف بالبيئة ذات الطورين double phase culture حيث يتم وضع المُستأصل النباتي على سطح البيئة الصلبة ويضاف بعد ذلك البيئة السائلة على السطح فتعمل البيئة الصلبة على تثبيت المُستأصل النباتي وتقوم البيئة السائلة بتغذيته. وبذلك يمكن إحداث تغيير في محتويات البيئة بأن تضاف مثلاً منظمات نمو لتشجع التجذير بدلاً من نقل الأشطاء إلى أوعية جديدة محتوية على بيئة جديدة وللحد من التكاليف إنتاج النباتات باستخدام الوسط شبة الصلب تستعمل البيئات السائلة فقط أو كلا الوسطين في نفس المزرعة ويكثر استعمال المزارع السائلة في المعلق الخلوي والأجنة الجسدية ومزارع الجذور على العكس من الإكثار الدقيق وإنتاج النباتات بالرغم من أن التصاق كل المزرعة بالوسط المغذى سوف يشجع امتصاص المزيد من مركبات البيئة وبالتالي تحفيز النمو (2007) .Mehrotra et al.

ويعمل استمرار حركة المزرعة على الحد من تأثير السيادة القمية وبالتالي إنتاج المزيد من البراعم التي ربما تنفصل عن بعضها تلقائياً نظراً للحركة الميكانيكية للمزرعة وبالتالي يقل التنافس بين الميرستيمات الذي ذكر آنفاً وتشجع هذه العوامل على استخدام الميكنة في العديد من مراحل زراعة الأنسجة. وسجل .Piatczaka et al (2005) زيادة مقدارها ثلاثة أضعاف في عدد اشطا Centaurium erythraea عند استعمال البيئة السائلة بالمقارنة مع البيئة شبة الصلبة. وصاحب ذلك زيادة في الوزن الكلى الرطب والجاف للأشطاء لكن انخفض وزن الأشطاء الفردية كذلك كانت الأوراق صغيرة ونحيلة. وبالطبع يتوقع أن تكون مشكلة التميز المائي من المشكلات الأساسية التي تعيق استعمال البيئات السائلة إلا أن ذلك يرتبط بالنوع النباتي ومستوى السيتوكينين. وأمكن تجذير الأشطاء التي تكشفت في وسط سائل عقب نقلها إلى بيئة شبة صلبة بصرف النظر عن التميز الزجاجي. وبعد الأقلمة كان وزن النباتات التي تكشفت سابقاً في بيئة سائلة أعلى من تلك التي تكشفت في وسط شبة صلب، وربما يفسر ذلك بمخزون الأشطاء المرتفع من السكريات والمواد الأخرى.

ونظرا لحاجة الأنسجة المنزرعة المثلى من الأكسجين فإن البيئة السائلة الثابتة لا توفر حاجة النسيج من الأكسيجين وهذا بفرض أن الأنسجة غير منزرعة في طبقة رقيقة من البيئة مثل نظام النقطة المعلقة. وإذا كان من الضروري استعمال البيئة السائلة ولا توجد وسيلة لجعل البيئة متحركة لضمان التهوية فتستعمل طبقة رقيقة منها بحيث يكون جزء من المُستأصل النباتي معرضاً للهواء، أو جعل النسيج يطفو فوق السطح باستعمال بعض المواد التي تزيد كثافة البيئة مثل Ficoll. أما الطريقة الشائعة للتهوية في المزارع السائلة فهي استعمال أجهزة رج أو تدعيم النسيج فوق ورق ترشيح. وفي مجال الإكثار التجاري وباستعمال زراعة الأجنة على وجهة الخصوص تستعمل بعض المفاعلات الحيوية Bioreactor صغيرة الحجم والموضح في شكل رقم (1).

وفى الغالب تقتصر استعمال المفاعلات الحيوية على مرحلة تضاعف الخلايا وتكوين الأجنة الجسدية، ثم تنقل الخلايا أو الأجنة المتكونة إلى بيئة شبة صلبة لتكشف الأشطاء أو النباتات ويختلف تصميم المفاعل تبعاً للهدف من استعماله مثل المزارع كبيرة الحجم كمعلق الخلايا الذي يستعمل لإنتاج المواد الفعالة معملياً أو بغرض تحويل بعض المواد الأولية إلى مواد ذات أهمية خاصة. لكن عموماً تتم التهوية عن طريق دفع تيار من الهواء المعقم إلى داخل المزرعة (2005 ,.Paek et al). وهو نفس النظام المتبع في زراعة الخلايا البكتيرية إلا أن هناك بعض العيوب لاستعمال البيئة السائلة بهذا النظام، نظرا للاختلافات الكبيرة بين المزارع البكتيرية والأنسجة النباتية كحساسية بعض الأنسجة لعمليات الرج والضرر الميكانيكي shear stress وتكوين فقاقيع ورغوة داخل النظام.

شكل 1: إلى اليسار المفاعل الحيوي Bioreactor المستعمل لزراعة المعلق الخلوي لنباتات Euphorbia pulcherrima وإلى اليمين النباتات التي تم أقلمتها (1991 ,.Preil et al).

وقد نجح استعمال المفاعلات الحيوية بصورة كبيرة في إنتاج درنات البطاطس وبصيلات Lillium والتي تزرع مباشرة في حقول الإنتاج وأمكن استخدام بعض التصميمات الحديثة من المفاعلات الحيوية والتي يعتمد التقليب فيها على دفع تيار من الهواء مثل BTBB في إكثار بعض النباتات مثل التفاح والعنب والبيجونا والأناناس وغيرها باستخدام البراعم العرضية وهو الأمر الذى لم يكن من السهل تحقيقه باستخدام التصميمات القديمة 2005 .Pae et al). ونظراً لصغر حجم الأجنة الجسدية وتماثلها وعدم الحاجة إلى تقطيعها وزراعة كل جزء مستقلاً عن الأخر كما هو الحال في مزارع الأشطاء فإنه يسهل استعمال المفاعلات الحيوية في الإكثار التجاري للكثير من الأنواع. ولعل من المناسب هنا التعرض لمزارع الغمر المؤقت نظرا لاستخداماتها الحديثة في الإكثار التجاري للتغلب على عيوب المفاعلات الحيوية وعدم إمكانية استخدامها في الإكثار التجاري.

أنظمة الغمر المؤقت

نظرا لعيوب استعمال أجهزة bioreactor وصعوبة استخدامها في إنتاج نباتات في مزارع الأنسجة اتجه البعض إلى ابتكار نظم جديدة يعتمد على استعمال الوسط السائل مع محاولة تلافي عيوب المفاعلات الحيوية فيما يعرف بنظام الغمر المؤقت Temporary Immersion System (شكل رقم 2). وكان كلا منHarria (1983) & Mason رواد في هذا الاتجاه حيث تمكنا من عمل أول نظام يعتمد هذه الفكرة وسمى بالـ Tilting System وسمى الجهاز بالـ Auxophyton ويضمن تصميم الجهاز غمر الأجزاء المنزرعة في الوسط السائل ثم تعرضها للهواء لتوفير الأكسجين. وعند استعمال هذا الجهاز لأول مرة في زراعة أنسجة الجزر حققت زيادة في الوزن أعلى 2.6 مرة من تلك التي سجلت باستعمال وسط شبه صلب. ولا تتوقف أهمية استعمال TIS على زيادة الوزن بل في كثير من الدراسات كانت النباتات الناتجة ذات جودة عالية. فعلى سبيل المثال استخدم (2008) Yang & Yeh نظام TIS في الإكثار الدقيق لنباتات Calathea orbifolia بهدف التغلب على انخفاض معدل الأقلمة. وأشار إلى تأثير نظام المزرعة على التركيب التشريحي لأوراق فزاد سمك الخلايا الكلورنشيمية والتي تلعب دور هام في الأقلمة في نظام TIS بالمقارنة مع البيئة شبة الصلبة. ولم يتوقف الأمر عند ذلك بل زاد سمك طبقة الشمع على الأوراق وقل عدد الثغور على وحدة المساحة، وربما يرجع ذلك إلى زيادة معدل التهوية في هذا النظام. وكانت قدرة النباتات من نظام TIS على الأقلمة والنمو في البيت المحمي أفضل. لكن على العكس من ذلك اتضحت ظاهرة التميز الزجاجي في حوالي نصف الأشطاء الناتجة من TIS والتي لم يتغير عددها الكلى بالمقارنة مع استعمال البيئة التقليدية (2009 ,.Shaik et al). ثم توالى ابتكار عدد من هذه الأنظمة عقب استخدام Auxophyton. وتصنيف هذه الأنظمة على أساس طريقة عملها إلي :

شكل 2: رسم تخطيطي يوضح فكرة المفاعل الحيوي المعتمد على الغمر المؤقت في اليمين، ونظام الغمر المستديم ذو شبكة لتدعيم النمو في الوسط وآخر بدون شبكة تدعيم في اليسار (2003 ,.Piao et al).

Tilting & rocker machines

يعتمد على الحركة المائلة للأوعية ذات الانبعاجات الخارجية التي تشبه القوارير.

Complete immersion of plant material & renewal of the nutrient medium.

يعتمد على غمر كامل للأجزاء النباتية مع تجديد البيئة السائلة.

Partial immersion & a liquid nutrient renewal mechanism

غمر جزئي للأجزاء النباتية مع تجديد البيئة السائلة.

Complete immersion by pneumatic driven transfer of liquid medium &

without nutrient medium renewal

غمر كامل للأجزاء النباتية بنظام الإزاحة الغازية للبيئة السائلة غير المتجددة.

ولمزيد من المعلومات عن تركيب وكيفية عمل هذه الأنظمة وتأثيراتها على إكثار العديد من الأنواع النباتية يرجع إلى المقالات المرجعية (1999) Ziv و Etienne (2002) Berthouly & وكذلك (2005) .Paek et al. ويلاحظ أن الاختلاف بين هذه الأنظمة يكون في حجم الجهاز ، ونوع المزرعة المستعملة فيها، ووجود الحاسوب واستعماله في حساب مدة الغمر أو استعمال مؤقت بسيط، وجود مضخة هواء من عدمه، واستعمال البيئة مرة واحدة أو إعادة استعمالها في دورات متتالية وانفصال خزان البيئة عن أوعية الزراعة أو دمجهما معاً. وعلى أي حال فإن هذه الأجهزة كان لها تأثيرات إيجابية على عملية الإكثار الدقيق. ومن الدراسات المرجعية التي تمت الإشارة إليها سابقاً يمكن استخلاص المميزات التالية عند مقارنة هذا النظام مع البيئات شبة الصلبة أو السائلة كما يلي:

أ. مرحلة تكشف الأشطاء: عند استعمال هذا النظام لإنتاج أشطاء في Pinus radiata أمكن استمرار الإنتاج لمدة 18 شهر باستمرار تجديد البيئة ودون الحاجة لتقسيم ونقل المزرعة كما هو الحال عند استعمال البيئة شبه الصلبة. وخلال هذه المدة أمكن فصل الأفرع المناسبة للتجذير ونقلها من الجهاز، وتميزت هذه الأفرع بزيادة عددها وطولها مقارنة ، مع تلك البيئة في شبة الصلبة.

ب. تكوين الدرنات: تحسين معدل النمو وتكوين الدرنات في البطاطس باستعمال أحد أنظمة الغمر المؤقت بالحصول 500 - 690 درنة في الجهاز خلال 10 أسابيع مقابل 220 درنة باستعمال النظام التقليدي Jar fermentor وكان هناك أيضا زيادة في الوزن الكلى للدرنات وزيادة في درجة التجانس باستعمال الغمر المؤقت. وفي المقابل لم تتكون أي درنات في نظام الغمر المستمر. وكان معدل تكوين الدرنات هو 3 درنات/ عقلة محتوية على برعم واحد وحقق أكثر من 50% من الدرنات الناتجة وزنا أعلى من 0.5 جم / درنة مع تفتحت 3-4 عيون من كل درنة في نفس المزرعة مكونة أفرع.

ج. تكوين الأجنة الجسدية: استعمل أحد أنواع هذا النظام لتكوين الأجنة الجسدية للجزر ونخيل البلح الذي يعتمد على الغمر لمدة 5 - 10 دقائق كل ساعتين. وسجل بذلك زيادة 1.9 مرة في معدل تكوين الأجنة الجسدية للجزر وزيادة 4 مرات لتكوين الأجنة الجسدية في نخيل البلح مقارنة مع البيئة شبة الصلبة. والأكثر أهمية من زيادة معدل تكوين الأجنة هو التحسن في نوعية الأجنة الناتجة.

د. تطور الأجنة الجسدية: تم إنتاج الأجنة الجسدية لـ Citrus deliciosa في معلق خلوي وتتبع تطورها في نظام الغمر المؤقت ونظام المعلق الخلوي باستعمال هزاز بسرعة 100 دورة بالدقيقة أو البيئة شبة الصلبة. في الحالة الأخيرة وجد أن 60% من الأجنة نمت وكونت أوراق فلقية لكن كان بها ظاهرة التميز الزجاجي أما عند استعمال نظام الرج لم تتكون الأوراق الفلقية وتوقف تطور الأجنة عند الطور الكروي globular في حين أدى استعمال نظام الغمر المؤقت إلى تكون الأوراق الفلقية في 66% من الأجنة المنزرعة والتي كانت كبيرة الشبه بالأجنة الجسدية المتكونة من نسيج النيوسيلة. كذلك انخفض عدد الأجنة الثانوية وهي ظاهرة غير مرغوبة المتكونة على الجنين الأساسي.

العوامل التي تؤثر في مدى استجابة المُستأصل النباتي لنظام الغمر المؤقت

أ. زمن الغمر: فترة غمر النسيج في الوسط المغذى هي الفترة التي يتمكن فيها النسيج من امتصاص المواد المختلفة من البيئة وكذلك غسل المواد المخرجة من النسيج والتي تكون موجودة على سطحه. وتعتبر فترة غمر النسيج من العوامل شديدة التأثير في ظاهرة التميز الزجاجي. ويتباين زمن الغمر الأمثل ومدى تكراره حسب النوع النباتي ونوع النسيج وطور النمو والنظام المستعمل. وقد وجد أن الزمن الطويل للغمر بمعدل (يصل إلى 1-6 ساعات) فعال في إنتاج درنات البطاطس، أما الغمر لمدة دقيقة واحدة كل 12 ساعة فكان هو الزمن الأمثل في إنتاج الأجنة الجسدية في نباتات البن العربي. أما بالنسبة لإنتاج أشطاء العنب فقد كان أفضلها هو تكرار الغمر في البيئة لمدة 30 ثانية كل 30 دقيقه.

ب- حجم البيئة: إذا لم تكن البيئة متجددة كما في بعض الأنظمة مثل نظام Twin flasks فلابد من تحديد الحجم الأمثل للبيئة. وكان الحجم الأمثل عند زراعة أنسجة Saccharum spp هو 500 مل حيث زاد معدل تكوين الأشطاء من 8.3 لكل جزء نباتي إلى 23.9 خلال 30 يوم من الزراعة. لكن لم يؤثر الحجم في طول الأشطاء المتكونة. وكان الحجم الأكبر من البيئة أقل كفاءة في الإكثار، وعلل ذلك بأن المزرعة تنتج بعض المواد المشجعة للنمو، وبزيادة حجم البيئة يحدث لهذه المواد تخفيف مما يؤثر سلبيا على النمو.

ج. حجم الأوعية: سبق القول بأن حجم الوعاء من العوامل المؤثرة في الإكثار الدقيق بوجه عام ويزيد هذا التأثير بالإضافة إلى حجم الفراغ الموجود في الوعاء في أنظمة الغمر المؤقت. وفي هذه الأنظمة تستعمل أوعية ذات أحجام تتراوح بين 1-20 لتر. وأمكن الحصول على أشطاء أطول وأقوى نموا في العنب في حالة استعمال أوعية أكبر حجماً.

د. التهوية: يعد نقص الأكسجين في البيئة السائلة من أهم العوامل التي تؤثر سلبيا على نمو الأنسجة المنزرعة وخاصة صغيرة الحجم، ويتضح هذا في حالة استعمال الأنظمة التي لا تجدد فيها البيئة. فلم يكن هناك تحسن في نمو أنسجة الموز عند استعمال نظام التقليب وذلك بزراعة أنسجة صغيرة الحجم نسبياً منه. بينما أدى دفع تيار من الهواء في البيئة إلى تحسن في النمو، وكانت أنظمة الغمر الجزئي أفضل الأنظمة التي استخدمت في إكثار الموز. ويلاحظ أن الأنظمة المختلفة تختلف عن بعضها من ناحية توفير الأكسجين والتهوية والرطوبة النسبية. ويعتبر أفضلها في التهوية هو النظام الذي يضم مضخة لدفع الهواء مع دفع البيئة إلى الوعاء المحتوى على المزرعة ثم إعادة سحبه مرة أخرى.

تأثير الزراعة بنظام الغمر المؤقت على النباتات الناتجة

أ. الصفات الظاهرية: كانت مجموعات أشطاء الأناناس التي تكشفت في بيئة سائلة باستعمال Bioreactor ذات شكل كروى غالباً وتبدو وكأنها تنمو حول نقطة مركزية. وأغلب تلك الأشطاء كان صغير الحجم وغير مناسب للتجذير والأقلمة وتطلب الأمر إجراء مرحلة خاصة للاستطالة والتجذير. أما الأشطاء الناتجة في نظام الغمر المؤقت فكانت أطول ونموها أفضل إلا أن أوراقها كانت أصغر حجماً. تحافظ بعض أجهزة نظام الغمر المؤقت على القطبية مثلها مثل استعمال البيئات شبة الصلبة على النقيض من استعمال Bioreactor. وأشار عدد كبير من الباحثين أن هذا النظام كان أفضل من استعمال البيئة شبة الصلبة لإكثار أنواع نباتية متباينة، حيث كانت الأشطاء أطول وأثقل وزناً وربما يرجع ذلك لمعدل التهوية أو لكبر حجم الإناء مما يسمح للأشطاء بالاستطالة. وكذلك في حالة إنتاج الأجنة الجسدية.

ب. ظاهرة التميؤ الزجاجي: رغم أن الزراعة في البيئة السائلة لها العديد من المميزات إلا أن أحد أهم عيوبها هي حدوث ظاهرة التميؤ الزجاجي. وذلك نتيجة استمرار ملامسة النسيج للبيئة وانخفاض معدل التهوية مما يؤدى إلى تغيير في بعض الصفات الظاهرية والفسيولوجية للأنسجة. ويمكن التغلب على هذه الظاهرة في هذا النظام بزيادة التهوية وتقليل زمن التصاق البيئة بالنسيج. وقد سبق الإشارة إلى ضرورة تحديد الزمن الأمثل لمدة الغمر وتكراره، وبالطبع تزداد هذه الظاهرة بزيادة مدة الغمر وقصر الفترة الفاصلة.

ج. الأقلمة: تميزت النبيتات الناتجة من هذا النظام لمعظم الأنواع التي تم دراستها كقصب السكر ، الموز، البن وغيرها بقدرة عالية على الأقلمة مقارنة مع النبيتات الناتجة من استعمال البيئة السائلة أو شبة الصلبة فقد وصلت نسبة نجاح الأقلمة إلى 95 : 100% في قصب السكر وكان طول النبيتات المنقولة لا يقل عن 6 سم. وامتد هذا التأثير إلى مرحلة النمو بعد الأقلمة في نباتات Callistephus hortensis حيث كانت صفات النمو المختلفة أفضل من تلك النباتات الناتجة في بيئة شبه الصلبة.

2. نوعية الأوعية

تتباين نوعية الأوعية المستعملة في زراعة الأنسجة لكنها لابد وأن تفي بشرط الشفافية ليسهل رؤية المزرعة وفحصها بالإضافة لمرور الضوء. ومن ثم يمكن استعمال الزجاج أو البلاستك بأنواعه المختلفة. وعادة يفضل استعمال تلك المصنوعة من الزجاج حيث يمكن استعماله مرات عديدة مع سهولة غسيله وتعقيمه. لكن يلاحظ أن الأنواع الرخيصة الثمن من الزجاج غير مناسبة بشكل مطلق حيث تتحرر منها بعض المواد الضارة للمزرعة ويبدأ حدوث ذلك بعد فترة 12 - 18 شهر من التصنيع. وهناك بعض الطرق الكيميائية لإعادة الأوعية بعد هذه الفترة إلى حالتها الأولى أي قبل تحرر هذه المواد (1993 ,George). أما البلاستيك فهو سهل الاستعمال لكن الأنواع ذات القابلية للتعقيم الحراري غالية الثمن. وعموماً على النطاق التجاري يستعمل الزجاج العادي أما في أغراض البحث العلمي فيجب استعمال أنواع جيدة من الزجاج Invigorated (IG).

بالطبع يلزم تغطية الأوعية المستعملة لتجنب حدوث تلوث المزرعة لكن يجب عدم إحكام الغلق إذا كانت مادة الغطاء غير منفذة للغازات حتى يسمح بالتبادل الغازي لكن من الضروري الحفاظ على عدم تلوث البيئة وعدم جفافها بدرجة عالية ويضيف (2003 ,Jackson) أن النباتات في الأوعية محكمة الغلق هي بمثابة النباتات النامية تحت سطح الماء، لكن في الحالة الأخيرة فإن بعض النباتات قد تأقلمت على التغلب على هذه الظروف. ويتم صناعة الأغطية من مواد مختلفة مثل القطن والبلاستيك والمعادن كالالومنيوم ويتوقف عدد مرات حدوث إحلال الغازات الداخلية بالغازات الخارجية على نوع مادة الغطاء. ويمكن رفع هذا المعدل 3-6 مرات باستعمال الأغشية المنفذة مثل البولي بروبلين. وقد قورن معدل التبادل الغازي الحادث في ساعة واحدة لأنابيب زراعة حجمها 45 مل وذات قاع مسطح ومغطاة بغطاء من الألومونيوم أو البلاستيك أو المطاط فكانت 0.18 ، 1.5، 0.6 سم3 على التوالي. لكن يجب الأخذ في الاعتبار أن المواد البلاستيكية سواء كانت أوعية أو أغطية تتحلل منها بعض المواد المتطايرة التي تذوب في البيئة وقد تؤثر على مدى استجابة المُستأصل النباتي (George, 1993).

ولعل من المفيد أن يشار إلى دراسة (2005) .Islam et al حيث قام بإكثار عدة طرز وراثية من النعناع باستخدام أنواع مختلفة من الأوعية؛ هي برطمانات مصنوعة من الزجاج التجاري (IG) سعتها 330 مل، وأوعية الزراعة المعروفة بـ (Magenta vessels (MV التي يتيح تصميم غطائها التبادل الغازي وسعتها 380 مل، والدوارق المخروطية (EF) سعة 163 مل وأنابيب الزراعة سعة 53 مل. وتم تغطية البرطمانات بعد وضع قرص من القطن بين الغطاء والفوهة ليضمن التبادل الجيد للغازات، أما أنابيب الزراعة والدوارق فتم تغطيتها بورق الألمونيوم ضغط باليد حول الفوهة. وكان حجم البيئة المستعمل في الأوعية السابقة هو 50 و 40، و 30، و 10 مل على التوالي وزرع بكل وعاء 5، و5، و3 في الثلاث أنواع الأولى من الأوعية أما النوع الرابع فزرع به مستأصل واحد (CT1) أو مستأصلين (CT2). وقد قام بقياس عدد هام من المتغيرات التي تأثرت بنوعية الأوعية (جدول 1 ). ويتبين أن أعلى فقد في وزن البيئة وكذلك البخر نتح ووزن للنباتات كان عند استعمال أوعية من الزجاج التجاري، بينما كان أقل نقص في البيئة ووزن النباتات كان عند استعمال أنابيب زراعة تحتوي على مستأصلين نباتين وبدون زراعة المُستأصلات في الأوعية كان الفقد في البيئة وزيادة الفراغ الداخلي أعلى في حالة الأوعية المصنوعة من الزجاج التجاري. وعموما كان أفضل نمو بزراعة النباتات في الأوعية التي تضمن التهوية.

جدول 1: تأثير نوع الوعاء على مزارع القمم النامية للنعناع (,.Islam et al 2005)

تقلل سرعة التبادل الغازي في جو المزرعة من ظاهرة التميؤ الزجاجي وتحسن من النمو في عديد من النباتات مثلا لبطاطس والطماطم و Gypsophila paniculata و Dianthus caryophyllus . من الأمثلة التي توضح أثر الغطاء على زراعة الأنسجة كنتيجة لتأثيرها في التبادل الغازي ومحتوى الرطوبة داخل الإناء ما أوضحه (2000) .Tsuro et al عند استعماله نظامين لتغطية الأوعية المستعملة لإكثار نباتات Lavandule vera الأول نظام مقفول closed culture system وفيه استعمل ورق الألمونيوم. أما النظام الثاني فهو النظام المفتوح open culture system حيث استعملت نفس المادة مع ترك فتحات مربعة الشكل طول ضلعها 7 مم غطيت بمرشح ذو أقطار 0.25 ميكروميتر ليسمح بالتبادل الغازي. وأتضح أن الأشطاء التي تكونت في النظام المفتوح كانت أكثر طولاً ولم تتضح فيها ظاهرة التميز الزجاجي وأرجع ذلك لخفض تركيز ثاني أكسيد الكربون في الجو الداخلي ومنع تكثف بخار الماء على السطح الداخلي للوعاء وامتد هذا التأثير إلى مرحلة التجذير ، فالأشطاء التي تكونت في النظام المفتوح كونت عددا أكبر من الجذور مقابل 1-5 جذر لكل نبات فقط في النظام المقفول. كما كان هناك تداخل واضح بين النظام المتبع ومنظمات النمو المستعملة للتجذير. وكان لاختلاف القدرة على التجذير وظاهرة التميؤ الزجاجي ارتباط بالقدرة على الأقلمة حيث أمكن لـ 95% من النباتات الناتجة من النظام المفتوح الأقلمة مقابل 33% فقط للنباتات الناتجة من النظام المقفول.

كما يتباين حجم الأوعية المستعملة في زراعة الأنسجة وهناك العديد من الأمثلة التي توضح تأثير حجم الوعاء على النمو والتكشف عن طريق:

أ. تأثيره على محتواه من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون والإثيلين والمواد الطيارة الأخرى.

ب. اختلاف النسب المختلفة بين العناصر وبعضها وحجم المُستأصل النباتي والفراغ الغازي وحجم البيئة.

ج. تأثيره على معدل انتشار الغازات من وإلى الوعاء.

وعادة يكون الوعاء الأكبر حجماً أفضل إذا كان معدل النمو عالي، أما إذا كان المُستأصل النباتي صغير الحجم ومعدل النمو بطيء فيفضل الوعاء الأصغر حجما.

ويقلل الإناء الأصغر حجماً من التكشف وقد يتعدى ذلك الأمر إلى تأثيره على مواصفات الأفرع المتكشفة، ففي مزرعة أشطاء نباتات Gerbera كانت الأشطاء الناتجة في مخبار سعته 125 مل أفضل من تلك الناتجة من أنابيب 25 /150 مم وكان معدل التجذير أفضل عند استعمال أوعية سعة 250 مل. بمعنى أن هناك حجم أمثل لكنه يختلف باختلاف النوع النباتي ونوع المزرعة ومرحلة زراعة الأنسجة ونوع مادة الإناء وحجم البيئة وكثافة الزراعة. كما يلعب شكل الإناء دورا في ذلك حيث يكون معدل انتشار الغازات أعلى في الوعاء القصير بالمقارنة مع الطويل رغم أن كلاهما متساويان في الحجم (2003 ,Jackson).

3. الغازات

خلال عقود طويلة افترض أن المكونات المختلفة للبيئة في القوارير هي العناصر الأساسية التي يمكن عن طريقها التحكم في نمو وتطور الأنسجة. ومما لا شك فيه أن الهواء من ضروريات نمو النباتات فلا يمكن للأنسجة أن تعيش بدون الأكسجين، أما ثاني أكسيد الكربون فهو حجر الأساس في عملية البناء الضوئي. والمكون الآخر الذي يوجد بنسبة عالية في جو المزرعة هو الإثيلين والذي ينظر إليه الآن على أنه هرمون نمو وليس كمركب سام للخلايا حيث يؤثر في النمو والتطور بمعدل يتراوح بين 0.01 و 10 جزء في المليون. لكن لا يقف الأمر عند ذلك حيث أصبح من الثابت أهمية دراسة الغازات المختلفة في جو مزرعة الإكثار الدقيق، وقد تناول ذلك بالتفصيل (1993) George و (2003 ,Jackson) و (2005) Zobayed في مقالات مرجعية يمكن الجوع إليها للاطلاع على الكثير من المعلومات التي يناقشها هذا الجزء.

إن حاجة المزرعة للتهوية أو للتبادل الغازي بين جو المزرعة والفراغ الخارجي يعتمد على نوع المزرعة وحجمها وتلعب النسبة بين حجم الأنسجة إلى حجم الوعاء دور هام جداً في تأثير التبادل الغازي على نمو الأنسجة فالحجم الكبير للأنسجة يعني أن صغر الفراغ المتاح للانتشار الغازي ويتعدى الأمر ذلك حيث كبر حجم النسيج يعنى الانخفاض النسبي في التبادل الغازي للأنسجة الداخلية الغير ملامسة للهواء. لكن يعتبر الحد من تبادل الغازات عبر نوعية الأوعية والأغطية على رأس تلك العوامل السابقة والذي لا يحرم المزرعة من المكونات الطبيعية للهواء بل يرفع من الرطوبة النسبية وتركيز بعض الغازات الناتجة من عمليات الأيض كالإثيلين وأكسيد النتريت وغيرها. ومن ثم يلاحظ تثبيط عالي في عملية البناء الضوئي، والنتح، وامتصاص الماء والذائبات من البيئة وكذلك ثاني أكسيد الكربون مع زيادة في معدل التنفس في فترة الظلام وينعكس ذلك في النهاية على ضعف النمو والعديد من الصور غير الطبيعية في الشكل المظهري والتشريحي والوظيفي للنباتات في القوارير. وهناك بعض المواد الطيارة الأخرى التي تخلق في المزرعة مثل الإيثان، والميثان والاسيتيلين والاسيتالدهيد وقد تسبب بعض المشكلات مثل الموت الموضعي للأنسجة وتثبيط نمو النباتات إن لم يتم التخلص منها بالتهوية الجيدة لجو المزرعة.

وعلى الرغم أن كمية قليلة من الغازات يمكن أن تدخل وتخرج من أوعية الزراعة بسبب التباين الحادث في درجات الحرارة في غرفة النمو إلا أنه يحدث تغيير ملحوظ في المكونات الغازية في جو الإناء المستعمل نتيجة للانتشار الغازي. ويتراوح معدل تدفق الغازات في أوعية الزراعة بين 0 - 25 ملم/ساعة، ويتوقف ذلك على عدة عوامل منها شكل وحجم الإناء ومادة الغطاء ودرجات الحرارة وحركة الهواء الخارجي. ولعل عدم إحكام غلق الغطاء أو وضعه فقط فوق الفوهة دون غلقه يحسن بكثير معدل الانتشار الغازي، لكن قد يكون ذلك عامل كبير في تلوث المزرعة خاصة لو كان السكر هو مصدر الكربون في المزرعة. ويزيد معدل الانتشار الغازي بصورة ملحوظة باستعمال أشعة ضوئية ذات طول موجي قصير كذلك فإن إضافة الفحم المنشط إلى البيئة يزيد من معدل التدفق الغازي حيث يعمل الفحم على امتصاص الأشعة الضوئية مما يرفع من درجة حرارة البيئة فتتمدد الغازات الداخلية فيتم التبادل الغازي. وفى فترة الظلام ينكمش الهواء الداخلي ببرودة البيئة فتقل بمعدل 1 - 3 درجات بالمقارنة بفترة الإضاءة رغم ثبات درجة حرارة الغرفة في كلا الحالتين، فيدخل الهواء الخارجي وهكذا.

وتتوقف نسبة وجود الأكسجين في جو المزرعة على معدل انتشاره وغالباً يكون تركيز الأكسجين في سطح المُستأصل النباتي مساويا لنسبته في جو المزرعة لو كانت الأنسجة غير متحركة ومحاطة بغشاء رقيق جداً من البيئة أما الأنسجة المغمورة في البيئة الثابتة فيكون تركيز الأكسجين بها منخفضاً. ويزيد تركيز الاثيلين حول النسيج بزيادة سمك الغلاف المائي المحيط بالنسيج. ويمكن تغيير محتوى المزرعة من الأكسجين عن طريق تغيير تركيز الأكسجين في غرفة الزراعة أو بدفع تيار من الأكسجين إلى داخل الأوعية. ومن الطبيعي أن ينخفض محتوى الأكسجين في الأوعية محكمة الغلق حيث يستهلك جزء منه في التنفس ولا يتم تعويضه بعملية البناء الضوئي. وبما أن النمو والتكشف يتأثران بالتنفس عن طريق عدد من التفاعلات الكيميائية فإن التغيير الحادث في محتوى الأكسجين ينعكس أيضاً على النمو والتكشف. ويتبين أن الانتشار الغازي لا يكون كافياً في معظم الحالات لتحقيق النمو الأمثل، ومن ثم يتم زيادة معدل التبادل الغازي أما بتشجيع التبادل الغازي بالانتشار الطبيعي عبر استخدام أغطية خاصة كتلك المصنوعة polypropylene وهي عديدة ومن حيث نوعيتها وسمكها وقطر الثقوب الدقيقة بها وبالتالي تختلف فيما بينها في معدل تغير المحتوى الغازي الداخلي. لوقد استعمل البعض عدة طبقات من القطن، لكن قد يكون معدل الانتشار الغازي بهذه الوسيلة غير كافي خاصة في الأوعية كبيرة الحجم نسبياً. ولزيادة هذا المعدل يمكن دفع تيار من الهواء أو ثاني أكسيد الكربون إلى جو المزرعة . ويتضح أن معدل تبادل الغاز في حالة الاعتماد على التهوية الطبيعية متفاوت ويخضع للعديد من العوامل ولا يمكن التحكم فيه بدقة وعلى العكس من ذلك يمكن التحكم بدقة في معدل التبادل الغازي والرطوبة عن طريق دفع تيار من الهواء لفراغ المزرعة، ومن ثم يمكن الحصول على معدل نمو عالي (شكل رقم 3).

شكل 3: تركيز CO2 وصافي عملية البناء الضوئي (NPR)، وعدد مرات تبادل الغازات (N) والكتلة الحيوية في مزارع نباتات الكافور ذات الهوية الطبيعية أعلى وعن طريق دفع تيار من الهواء من أسفل (2005 ,Zobayed).

ويشير الشكل إلى اختلاف تركيز الغازات داخل الوعاء المستخدم لزراعة نباتات Eucalyptus في كلا النظامين وقد ارتبط ذلك بزيادة معدل البناء الضوئي والكتلة الحيوية للنبيتات. ويلاحظ أيضاً استهلاك ثاني أكسيد الكربون أثناء فترة الإضاءة عند استعمال التهوية بدفع تيار من الهواء مقارنة مع التهوية الطبيعية. لكن بزيادة معدل ثاني أكسيد الكربون الذى يتم دفعه للوعاء يمكن الحصول على ثابت في تركيزه، وكذلك زيادة معدل النمو (2001) .Zobayed et al . وقد وضح (2010) Ivanova & Van Staden أن لزيادة معدل التهوية دوراً بارزاً في التغلب على ظاهرة التميز الزجاجي في بعض نباتات Aloe polyphylla وكذلك زاد معدل التكشف وانخفضت نسبة نباتات Dianthus caryphyllus المتمنية زجاجياً خاصاً عند ارتفاع مستوى الفوسفات بالبيئة (2011 ,Mohamed) . ويعتبر ذلك من أساسيات دفع النباتات بالمزرعة لتعتمد على نفسها في تخليق السكر بعملية البناء الضوئي. وقد ناقش (2005) Zobayed العديد من الأنظمة التي صممت لرفع تركيز ثاني أكسيد الكربون في جو المزرعة.

تقوم الأنسجة المنزرعة بالتنفس وبالتالي تنتج غاز ثاني أكسيد الكربون الذي قد يستهلك جزء منه في البناء الضوئي إن كان هناك فرصة لحدوثه، حيث أن السكر وهو الهدف من عملية البناء الضوئي يتم إضافته للبيئة فتكون معظم الخلايا غير ذاتية التغذية. لكن بعض الأنسجة الخضراء وبعض الخلايا قد تكون ذاتية التغذية وتقوم بعملية البناء الضوئي وبالتالي يلعب تركيز ثاني أكسيد الكربون ودرجة الحرارة بالإضافة إلى الضوء دورا في نشاطها. ويبلغ تركيز ثاني أكسيد الكربون في جو الغرفة 0.035% لكن يلاحظ ارتفاعه في جو غرف الزراعة إلى 0.040-0.080 %، وليس من الضروري أن تكون نسبة وجوده في غرف الزراعة هي نفس نسبة وجودة في داخل جو المزرعة حيث يتوقف ذلك على معدل الانتشار الغازي. وبالطبع إن كانت الأنسجة المنزرعة غير خضراء أي لا تقوم باستهلاك جزء من ثاني أكسيد الكربون فإن تركيزه يزيد وقد يصل إلى 150 مرة أعلى من تركيزه خارج جو المزرعة. وتزيد هذه النسبة إلى 1000 مرة في حالة الظلام وإحكام غلق المزرعة حيث يستمر التنفس وتقف عملية البناء.

إذا كانت الكثافة الضوئية منخفضة أو تركيز ثاني أكسيد الكربون غير كافي للبناء الضوئي فإن الأنسجة أو النبيتات تصل إلى أقل من نقطة التعويض compensation point حيث يكون الصافي من عملية البناء غير كافي للتنفس ويؤدى ذلك إلى موت الأنسجة أو النبيتات. ورغم أن النبيتات الناتجة من زراعة الأنسجة تحتوي على نظام نقل إلكتروني فعال جدا لعملية البناء الضوئي إلا أن الإنزيمات الضرورية لهذه العملية لا تكون كافية بالمقارنة مع النباتات العادية. وتختلف قدرة النبيتات في مزارع الأنسجة في القيام بعملية البناء الضوئي في حالة أضافه السكر للبيئة فنباتات Dieffenbachia على سبيل المثال لها قدرة على تكوين السكر حتى في حالة إضافته للبيئة. ولوحظ أن معلق بعض الخلايا النباتية خصوصاً في حالة الكثافة المنخفضة يحتاج إلى ثاني أكسيد الكربون. ويعود ذلك إلى أهميته في تخليق بعض الأحماض العضوية والأمينية الهامة للنمو والتي لا يمكن تعويضها بمصدر خارجي. كذلك لوحظ تأثير ثاني أكسيد الكربون على التكشف المباشر من خلال تأثيره على تخليق الإثيلين، حيث أن ارتفاع تركيز ثاني أكسيد الكربون يزيد من تخليق الإثيلين ونفس التأثير المثبط للتركيز العالي من ثاني أكسيد الكربون أمكن إحداثه بإضافة المواد المثبطة لإنتاج الإثيلين.

4. الرطوبة النسبية

الرطوبة النسبية هي مقياس لكمية بخار الماء الموجودة في الغلاف الغازي منسوبة إلى الكمية الكلية من بخار الماء التي يمكن أن يتشبع بها هذا الغلاف الغازي. وفي بداية الأمر لم تلقى الرطوبة النسبية أهمية لدى المشتغلين بزراعة الأنسجة النباتية حتى تبين أثرها على ظاهرة التميؤ الزجاجي والنمو غير الطبيعي للأوراق. ويلاحظ عند استعمال الأوعية التقليدية وصول الرطوبة النسبية إلى معدل مرتفع جدا يصل إلى 100% فيلاحظ تكثيف قطرات الماء على السطح الداخلي للأوعية. ويترتب على ذلك الكثير من الآثار السلبية على النمو وربما التكشف (2011& 2010 ,Mohamed & Alsadon).

ولا يمكن أن تناقش الرطوبة النسبية بمعزل عن تأثير الأوعية والغازات كما سبق ذكر ذلك آنفا، وفي معظم المقالات والدراسات المعملية يتم الربط بين الثلاثة عوامل ونمو المزرعة George 1993)) و (2005 ,Zobayed) فاستخدام الأوعية والأغطية التي تسمح بالتهوية حتما ستقلل من الرطوبة النسبية الداخلية وقد تحسن من النمو وتزيد من نجاح نقل النباتات إلى البيت المحمي بشكل واضح، وربما يرجع ذلك ولو بصورة جزئية لزيادة معدل النتح ومن ثم امتصاص مكونات البيئة. فعند الإكثار الدقيق لنباتات القرنفل في أوعية توفر تبادل غازي بمعدل 0.11، و 0.21، و 0.68 و 0.86 / ساعة من حجم الهواء الداخلي لوحظ أن هناك تغيير في الصفات التشريحية لأوراق الأشطاء المتكشفة. وكان التركيب التشريحي للنباتات النامية في أوعية توفر معدل عالي من تغيير الهواء الداخلي مقاربة للصفات التشريحية للنباتات النامية في البيوت المحمية، حيث كانت الأوراق ذات طبقة كيوتيكل وجدر خلوية سميكة، لكن انخفض حجم الخلايا والمسافات البينية وزاد تركيز صبغات التمثيل الضوئي ووجود الأنسجة الدعامية. وتلك الصفات التشريحية ملازمة لزيادة معدل فقد الماء من النباتات والذي يزيد بزيادة معدل التهوية وأدت تلك الصفات التشريحية إلى ارتفاع نسبة النباتات التي أمكن أقلمتها. وتعمل التهوية على زيادة الجهد المائي للبيئة حيث تنخفض الرطوبة النسبية وقد يكون ذلك أحد أسباب اختفاء ظاهرة التميز الزجاجي بزيادة التهوية. وقد أوضح (1999) .Fal et al أن زيادة معدل التهوية يزيد من معدل تكوين الأشطاء الطبيعية في صنفين من القرنفل.

وتتوقف الرطوبة النسبية داخل أوعية الزراعة على درجة حرارة البيئة وطبيعتها ومعدل التبادل الغازي والرطوبة النسبية لغرفة الزراعة. فإذا كانت درجة الحرارة داخل الفراغ الغازي للوعاء هي نفس حرارة غرفة الزراعة والوعاء محكم الغلق فإن الرطوبة النسبية تكون نظرياً 98-99.5% أي أن الهواء الداخلي مشبع تماماً. لكن تنخفض الرطوبة النسبية بحدوث التبادل البخاري بين الفراغ الداخلي والخارجي. وأفضل رطوبة نسبية لغرف الزراعة هي 70 % وانخفاضها عن ذلك يؤدي إلى جفاف البيئة. ورغم أن ارتفاع الرطوبة النسبية هو أحد العوامل الرئيسية لحدوث ظاهرة التميؤ الزجاجي إلا أن انخفاض الرطوبة النسبية داخل الأوعية إلى 80-70 % غير ملائم لنمو معظم أنواع مزارع الأنسجة، فالأجنة الجسدية للجزر تموت إذا انخفضت الرطوبة إلى 60% وكذلك قل عدد الأفرع المتكشفة من نبات Pelargamim عند انخفاض الرطوبة عن 75%. وعند تنمية أفرع البطاطس لمدة 22 يوم تحت مستويات مختلفة من الرطوبة النسبية شجعت الرطوبة النسبية العالية نمو الأفرع لكن انخفض حجم الورقة ولم يتأثر الوزن الجاف للنبات. وتؤدى التهوية بدفع تيار من الهواء داخل القوارير خفض الرطوبة النسبية بشكل كبير ينعكس بتأثير سلبي على النمو. ويمكن التغلب على ذلك بزيادة حجم البيئة في القوارير، أو برفع الرطوبة النسبية في غرفة النمو، أو بترطيب الهواء المستعمل في عملية حقن المزرعة.

كما تتوقف الرطوبة النسبية داخل الفراغ الداخلي للوعاء على نسبة مساحة المسطح الورقي الموجود، فزيادة المسطح الورقي تزيد من معدل البخر وبذلك ترتفع الرطوبة النسبية. ومن ثم ينصح بزيادة عدد الأفرع المنزرعة عند استعمال أوعية كبيرة الحجم. ويمكن أن ترفع الرطوبة النسبية داخل الوعاء بوضع كأس به ماء داخل وعاء الزراعة وقد اتبع ذلك في مزرعة لأفرع نبات Chrysanthemum morifolium. لكن قبل مرحلة نقل النباتات من المعمل إلى ظروف الأقلمة خارج المعمل يفضل خفض الرطوبة النسبية للمساعدة في أقلمة النباتات وإن كان ذلك يعمل على خفض معدل النمو والتجذير.

5. الحرارة

تتعرض النباتات في البيئة الطبيعية إلى تباين في درجات الحرارة على مدار الأربع والعشرين ساعة. ومن الأفضل أن تعرض مزارع الأنسجة إلى معدل متباين من درجات الحرارة خلال الليل والنهار أي في وقت الظلام والإضاءة إن أمكن ذلك. وقد لوحظ معدل أفضل للنمو والتكشف لعديد من النباتات عندما انخفضت درجة حرارة الليل إلى 4-8 م عن درجة حرارة النهار لكن من الناحية التطبيقية تستعمل معظم المعامل درجة حرارة ثابتة 22-24 م طوال الأربع والعشرين ساعة للنباتات ثلاثية الكربون. أما النباتات رباعية الكربون والنباتات ذات الأيض الحامضي crassulacean acid metabolism (CAM) فربما تحتاج إلى رفع درجات الحرارة إلى 35 م للحصول على أفضل نمو وتكشف (2009 ,.Amoo et al). وتتباين درجة الحرارة المثلى باختلاف النوع النباتي ونوع المزرعة ومرحلة النمو والغرض منها وغالباً تكون هذه الدرجة أعلى قليلاً من تلك الموجودة في الحقل، فالنباتات الاستوائية تحتاج درجة حرارة 24 - 32 م بالمقارنة مع النباتات الواقعة في المنطقة المعتدلة حيث تحتاج درجة حرارة 20-22 م. هذا مع الأخذ في الاعتبار أن درجة الحرارة داخل الوعاء تكون أعلى عدة درجات عن تلك خارج الوعاء كما أن حرارة البيئة أعلى من درجة حرارة الفراغ الداخلي (1993 ,George).

وقد كان نمو وتكوين أوراق جديدة لأشطاء النعناع عقب زراعة العقد الساقية أو القمم النامية أفضل عند درجة حرارة 25م بالمقارنة مع 20م، مع الأخذ في الاعتبار الفروق بين الطرز الوراثية المختلف التي استخدمها (2005 ,.Islam et al) في دراسته. لكن وجد (2009) .Amoo et al تداخل بين تأثير الحرارة وعدد ساعات الإضاءة حيث قام بتقييم قدرة مُستأصلات Huernia hystrix على التكشف ونمو الأشطاء تحت درجات حرارة متباينة مع استخدام إضاءة مستمرة لمدة 24 ساعة أو تحت 16 ساعة ضوء يعقبها 6 ساعات إظلام. وقد كان معدل التكشف 28 % عند درجة حرارة 15 م وارتفع إلى 83% عند درجة 20 م. وبالرغم عدم تأثير لدرجات الحرارة على النسبة المئوية للتكشف وعدد الأشطاء عند الإضاءة المستمرة، فإن رفع درجة الحرارة من 25 إلى 30 م قل من استطالة ووزن الأشطاء وكان 38 % من الأشطاء شاحبة اللون. أما عند نظام إضاءة 8/16 فإن أفضل معدل لعدد الأشطاء وكذلك طولها ووزنها كان عند درجة حرارة 35م (جدول رقم 2). وقد فسر ذلك بان درجات الحرارة العالية تحت الإضاءة المستمرة تقلل من معدل تخليق ATP و NADPH في النباتات ثلاثية الكربون وبالتالي يقل معدل تثبيت ثاني أكسيد الكربون الضروري للنمو. ويذكر الباحث أن انخفاض معدل النمو والتكشف عند درجة الحرارة المنخفضة قد يكون ذا أهمية في حفظ الأنسجة في القوارير، لأن قدرة هذه الأنسجة على النمو التكشف عند نقلها إلى درجة حرارة 25 م كانت أفضل من تلك التي زرعت مباشرة على نفس درجة الحرارة وكذلك هناك ملاحظات أخرى على التداخل بين درجات الحرارة والطاقة الضوئية على استطالة نبيتات البطاطس في مزارع الأنسجة (Kozai et al., 1995).

ولدراسة تأثير التغيير في درجات الحرارة أثناء فترات الإظلام والإضاءة على نمو نبيتات البطاطس تحت جو مشبع بغاز ثاني أكسيد الكربون يصل تركيزه إلى 1300- 1500 ميكرومول، باستعمال درجة حرارة ثابتة طوال اليوم 20 م أو 15/25 م أثناء فترات الإضاءة والإظلام على التوالي أو العكس أي أن المتوسط اليومي للحرارة هو 20 م في كل الحالات. ووجد أن طول الأفرع يزداد عند استعمال درجة حرارة أعلى 25م أثناء فترة الإضاءة و 15 م أثناء الإظلام، لكن لم يكن هناك تأثير على الوزن الرطب والجاف. وفى نفس التجربة وجد أن هناك تداخل معنوي بين الفرق في درجات حرارة الليل والنهار وشدة الإضاءة.

جدول 2: تأثير درجات الحرارة وطول الفترة الضوئية على التكشف ونمو أشطاء نباتات Huernia hystrix كما سجلها (2009) .Amoo et al.

في بعض الحالات تجب المعاملة بالبرودة لتشجيع التكشف أو النمو وكسر دور السكون الموجود في بعض النباتات كالأشجار الخشبية والأبصال. فأبصال Hippeastrum, Lilium, Hemerocallis في مرحلة النمو الثالثة من زراعة الأنسجة يجب تعريضها لمدة 50-140 يوم لدرجة حرارة 5 م حسب مكونات البيئة. لكن وجد أن تقسيم أبصال Freesia إلى قسمين يمكن أن يحل محل البرودة، أما في الأشجار الخشبية فإن المعاملة ببعض منظمات النمو مثل الجبريلين يمكن أن تحل محل البرودة. وفى بعض الحالات فإن المعاملة بالبرودة تكون ضرورية لدفع النباتات إلى التزهير بالذات النباتات ذات الحولين، فأفرع نباتات Senecio الناتجة من مزارع الأفرع تحتاج للمعاملة بدرجة حرارة 10م في المعمل لدفعها للإزهار بعد نقلها إلى خارج المعمل كذلك تستعمل درجات الحرارة المنخفضة لتقليل معدل نمو النبيتات في زراعة الأنسجة ويفضل أن يصاحب ذلك خفض الكثافة الضوئية. وأمكن حفظ نباتات البروكلي لمدة 6 أسابيع بخفض درجة الحرارة إلى 2م وباستعمال كثافة ضوئية 2 ميكرومول/ م2 / ثانية (1993 ,George).

6. الضوء

يعتبر الضوء عامل أساسي في تكوين الصبغات الملونة للنبات فالبلاستيدات الناضجة توجد في ثلاثة صور، إما خضراء لاحتوائها على الكلوروفيل، أو ملونة لاحتوائها على الصبغات الأخرى المسببة للون الأزهار والثمار، أو تكون البلاستيدات عديمة اللون كتلك المخزنة للمواد الغذائية مثل النشا أو الليبيدات. وعند حجب الضوء عن البلاستيدات الخضراء فإنها تفقد لونها وتتحول إلى عديمة اللون، والبلاستيدات عديمة اللون قد أن تتحول إلى خضراء عند تعرضها للضوء. والبادرات النامية في الظلام تحتوي على بلاستيدات بها بعض التراكيب الداخلية المميزة للبلاستيدات الخضراء لكنها لا تحتوي على كلوروفيل أما الكالس والخلايا المنزرعة معمليا في الظلام على العكس من ذلك بها بلاستيدات لكنها لا تحتوي على التراكيب المميزة للبلاستيدات الخضراء أو الكلوروفيل. وعند نقل الكالس أو معلق الخلايا إلى الضوء فإن بعضه قد يكون الكلوروفيل ويبدأ في عملية البناء الضوئي لكنه نادرا ما يصبح ذاتي التغذية الضوئية. وتستغرق عملية الاخضرار هذه وقت طويل نسبيا قد تستغرق 8 أسابيع للوصول إلى أعلى محتوى كلوروفيلي بالمقارنة مع النباتات الكاملة التي تنقل من الظلام إلى الضوء. وتعتمد القدرة على تكوين الكلوروبلاست على وجود الخلايا غير المنقسمة في كتل الخلايا وتكوين المناطق الخضراء في كتل الكالس يعتبر بداية عملية التكشف (1993 ,George).

لكن على الرغم من عدم أهمية الإضاءة بالنسبة لعملية البناء الضوئي حتى إذا كانت المزرعة تحتوي على نباتات خضراء فإن نوعية وطريقة توزيع الإضاءة في غرفة النمو له تأثير فعال على نمو المزرعة وجودة النباتات وليس الأمر كذلك فحسب بل يمكن بتعديل شدة ونوعية الإضاءة التحكم في نمو وتكشف مزارع البطاطس بطريقة تحاكي فعل منظمات النمو التي تقف وراء معظم التغيرات الوراثية في مزارع القوارير (2005 ,Seabrook). وترجع التأثيرات المختلفة للضوء على النباتات من حيث النمو والتطور عموما إلى وجود نظامين متخصصين لاستقبال الطاقة الضوئية الأول blue light/UV-A والثاني مستقبل UV-B وهما يتأثران بنوعية وكمية الإضاءة. لكن على العكس من تأثير الضوء على النبات الكامل فإن المعلومات حول تأثير الضوء وبالأخص نوعية الضوء على مزارع الأنسجة لا تزال قليلة Burritt& Leung 2003 رغم إشارة الكثير من المراجع إلى أهمية الضوء في مزارع الأنسجة.

وغالباً تستعمل لمبات الفلورسنت التي تثبت أفقيا فوق المزارع وأسفل الأرفف التي تحمل أوعية الزراعة للحصول على الإضاءة المناسبة وبطول موجي 400-700 نانوميتر. وتزود بعض الغرف أحياناً باللمبات العادية للحصول على جزء من الطول الموجي للمنطقة الحمراء. ويطلق على شدة الإضاءة المستعملة في غرف النمو والتي تقاس حديثاً بوحدات مكرومول / م2 / الثانية (Photon flux density (PFD وحتما تؤثر نوعية اللمبات وعددها وبعدها عن الأوعية على الطاقة الضوئية التي تصل إلى النباتات أو الأنسجة المنزرعة. وبالطبع يجب ألا ننسى نوعية الأوعية المستعملة في الزراعة وكذلك الأغطية ومدى نفاذيتها للضوء، فمهما كانت نوعية الأوعية والأغطية فلا بد وأن تقلل من انتشار الضوء في غرفة النمو وانتقاله من وعاء إلى آخر (1989 .Fujiwara et al). ومن العوامل التي تؤثر أيضاً في الإضاءة في غرف النمو موضع الأوعية على الأرفف ونوعية المادة المصنوعة منها وتأثيرها على امتصاص أو انعكاس الضوء 2005 Nguyen & Kozai).

ويشير (2005) Chen أن تكاليف استهلاك الكهرباء في مزارع الأنسجة تصل إلى 6% من التكاليف الكلية وتصل تكاليف إضاءة غرف الزراعة إلى 65% من هذه القيمة أما ال35% الباقية فهي تكاليف التبريد وللحد من تكاليف الإضاءة يمكن استعمال مزيداً من الأرفف لكن يسبب ذلك عدم انتظام في توزيع الإضاءة للأوعية المختلفة. ومن البديهي أن الإضاءة المستعملة في غرف النمو ينتج عنها قدر كبير من الحرارة التي يجب التخلص منها بالتبريد مما يزيد تكاليف الإنتاج. وللحد من ارتفاع درجات الحرارة يتم وضع اللمبات خارج غرف النمو وتنقل الأشعة الضوئية بعد التخلص من طاقتها الحرارية خلال ألياف زجاجية إلى غرف النمو أو يتم النقل باستعمال عدسات لتركيز الأشعة ثم تنقل لغرفة النمو. وبالطبع تلك طرق مكلفة لكن من الناحية التطبيقية يجب تثبيت مصدر الإضاءة في منطقة وسطى وغير ملامسة للأرفف الحاملة للأوعية. كما يمكن وضع اللمبات فقط داخل الغرف أما الأجزاء الملحقة بها والتي تولد قدرا كبيرا من الحرارة فتوضع خارج الغرفة. وفى بعض المعامل الكبرى يتم توزيع غرف النمو بحيث تكون فترات الإضاءة والإظلام فيها مختلفة ويتم سحب الهواء الساخن الموجود في الغرف المضاءة ليستخدم في تدفئة الغرف غير المضاءة وبالتالي الحد من تكاليف التبريد والتسخين (1993 ,George).

وتتعدد صور تأثير الضوء على نمو وتكشف النباتات وبعض العمليات الفسيولوجية المختلفة في مزارع الأنسجة والتي قد لا تتطلب امتصاص قدر كبير من الطاقة الضوئية لكن يمكن تحفيزها بالتعرض للضوء لمدة قصيرة. وقد يكون التأثير الضوئي غير مباشر عن طريق انتقال تأثيره في النبات الأم إلى المُستأصَلا لنباتي أو مباشر على المُستأصل النباتي. وجد (2003) Burritta & Leung أن حفظ النبات Begonia erythrophylla الأم في أطوال موجية مختلفة لمدة أسبوعين قبل بدء زراعة الأنسجة يوثر بشدة على معدل استجابة أعناق الأوراق للبيئة وكذلك على عدد البراعم المتكشفة. فيذكر أن كل المُستأصلات تقريباً كانت ذات قدرة على إنتاج حوالي 30 نبات لكل مستأصل عندما نمت الأم في الضوء العادي أو الأحمر، بينما انخفضت هذه النسبة إلى 35 و 30 و 7 % عند نمو النبات الأم في الضوء الأحمر البعيد والظلام والضوء الأزرق على التوالي، وكان عدد الأشطاء 15 و 10 و 3 لكل مستأصل. ومن والجدير بالذكر أن عدد كبير من المُستأصلات التي أخذت من أمهات نمت في الظلام ماتت عقب الزراعة بسبب زيادة تخليقها لمركبات عديدة الفينول. ومن الدراسة التشريحية وجد أن التثبيط يحدث لمرحلة تكوين الخلايا الميرستيمية وليس لتطور منشآت الأشطاء. ولم يكن التثبيط الحادث بسبب الضوء الأزرق راجع مباشرة إلى نظام الفيتوكروم لتكشف عدد من الأشطاء عند الزراعة تحت خليط من الضوء الأزرق والأحمر. وعلى العكس من التثبيط الحادث من الضوء الأحمر البعيد كان التثبيط بالضوء الأزرق غير قابل للانعكاس.

وعموماً لا يثبط الضوء نمو معظم الأعضاء النباتية بل قد يكون ضروريا للنمو الأمثل. تختلف الحاجة للضوء على حسب مرحلة المزرعة فأحيانا يتطلب الأمر بدء المزرعة في الضوء ثم نقلها للظلام أو العكس لحدوث استجابة معينة. فعلى سبيل المثال يتطلب إنتاج درنات دقيقة الحجم microtubers من بعض أصناف البطاطس زراعة النبيتات في الظلام عقب تشجيع نمو السيقان في الضوء (2003 ,.Piao et al). وأيضاً يلزم تطور أفرع من البراعم الزهرية لنباتات Freesia بدء المزرعة في الظلام ثم نقلها إلى الضوء .(1987 Bach,). لكن استنتج (2003) .Clayton et al عدم الحاجة إلى الضوء في المراحل الأولى من زراعة القمم النامية للموز. أما Zambre et al (2003) فيشير إلى أهمية الضوء في عملية نقل الجينات عند استعمال بكتيري Agrobacterium في التحويل الوراثي للفاصوليا والارابدوبسس. وينظر إلى تأثير الضوء على زراعة الأنسجة من ثلاثة أوجه وهي:

أ. الطول الموجي

يتكون الضوء العادي من عدة أطياف يمكن فصلها عن بعضها البعض ودراسة تأثير كلا منها على النمو والتكشف، لكن المتبع في معظم حالات زراعة الأنسجة هو الإضاءة بلمبات الفلورسنت والأطوال الموجية التي تؤثر على التكشف في القوارير كما ذكر (1988) Hart هي القريبة من فوق البنفسجية (300 - 380 نانوميتر)، الزرقاء (430 - 490 نانوميتر)، والحمراء (640- 700 نانوميتر)، والحمراء البعيدة (700-760 نانوميتر) أما الأطوال الموجية من 400 - 700 نانوميتر في المؤثرة في البناء الضوئي. ويتوقف الطول الموجي الذي تستقبله المزرعة على نوعية اللمبات المستخدمة وكذلك على نوعية الأوعية في غرف النمو. وتنتج لمبات الفلورسنت كمية أقل من الضوء الأحمر البعيد بالمقارنة مع لمبات الصوديوم. وتعتبر الأولى مناسبة لغرف الزراعة عند تثبيتها موازية للأرفف وعلى ارتفاع 40-50 سم من سطح المزرعة (2005) Nguyen & Kozai وتوثر النسبة بين الطاقة الضوئية في منطقة الضوء الأحمر والأحمر البعيد وكذلك نسبة الفوتونات في المنطقة الحمراء إلى الزرقاء على النمو والتكشف. وقد ذكر (2005) Nguyen & Kozai تشجيع تجذير عقل أشجار Azalia عند استخدام الضوء الأحمر أو الأحمر البعيد وليس الضوء الأبيض البارد باستعمال لمبات الفلورسنت كذلك شجع الضوء الأحمر تكوين الأشطاء ونموها في مزارع الجزر بينما تثبيط نمو الجذور من الأجنة الجسدية. ومن هذا يتضح مدى التباين بين تأثير الضوء الأحمر والأحمر البعيد والأزرق على التكشف، وربما يرتبط ذلك بالنوع النباتي (2003 ,Burritta & Leung).

بدراسة التكشف في بعض النباتات وجد أن الضوء الأحمر يتحكم في السيادة القمية بينما يتحكم الضوء الأزرق في عدد البراعم التي تتكون على المُستأصل عبر نظام استقبالي مختلف (2001 ,.Mule et al). وكذلك وجد (2000) .Kintzios et al ان حفظ مزرعة أوراق نباتات Capsicum annuum لمدة ثلاثة أسابيع عقب الزراعة في الظلام يزيد من عدد الأجنة الجسدية. لكن قد يتداخل تأثير الضوء مع العوامل الأخرى التي سبق الإشارة إليها حيث كان عدد الأجنة المتكون من الورقة الثالثة أقل من ذلك العدد المتكون من الورقة الأولى أو الثانية. لم يكن هناك فرق في عدد الأجنة المتكون في أنسجة من الورقة الثانية والثالثة عند حفظ المزرعة تحت 6/18 ضوء/ ظلام.

ونوه عدد من الباحثين إلى أن حفظ المزرعة في ضوء خافت يساعد على تكوين الأجنة الجسدية وتكشف الأشطاء في عدد من النباتات مثل Cucmis melo و C.sativus و Rosa . لكن تختلف هذه المدة وشدة الإضاءة المثلى باختلاف الانواع وعلى الرغم من أن كالس الدخان يستجيب إيجابياً إلى الإضاءة المنخفضة الزرقاء أو القريبة من فوق البنفسجية فإن التكشف والنمو الأمثل للأشطاء يحدث عند التعرض إلى الضوء الكامل أو منطقة الضوء الأحمر. وغالباً يتم تنشيط تكوين الكالس في الظلام وبعد ذلك ينقل إلى الضوء لدفعه للتكشف. وقد يؤدى الضوء الأزرق بكثافة عالية إلى تثبيط انقسام خلايا الكالس. ويرجع ذلك إلى التداخل بين منظمات النمو خاصة الأوكسينات والأطوال الموجية المختلفة، ففي مزارع Artichoke يزيد 2.4-D من حساسية الخلايا للضوء وفى غيابه لا يحدث التأثير المثبط للضوء. والأكثر من هذا يوجد طور معين في مرحلة انقسام الخلايا يكون حساساً للضوء دون غيره من أطوار الانقسام حيث يؤثر الضوء على تضاعف المادة الوراثية للخلية (1993 ,George). وقد فسر تأثير الضوء على مرحلة الكالس والتكشف بعدد من التفسيرات (1993 ,George) و (Seabrook, 2005):

* زيادة إنتاج المواد الفينولية التي تعيق نشاط معظم منظمات النمو.

* هدم إنزيم السيتوكروم اكسيديز المشترك في عملية التنفس.

* تكسير الحديد غير المخلبي وكذلك أكسدة المركبات المخلبية في البيئة.

* تنشيط تخليق حامض الجبريللين وقد تأكد ذلك بالتغلب على التأثير المثبط للضوء بإضافة إحدى المواد المثبطة لتخليق الجبريللين.

* قد يسبب الضوء رفع الرقم الهيدروجيني لبيئة MS إلى 7.

* تثبيط تخليق السيتوكينينات وتنشيط هدم اندول حامض الخليك وحامض الأبسيسك.

* يؤثر التفاعل بين الضوء الأحمر و IAA على تثبيط نمو الأشطاء وتكوين الدرنات في البطاطس. بينما يشجع الكنيتين في وجود الضوء الأزرق تكوين الدرنات.

ومن التأثيرات الواضحة أيضاً للطول الموجي في زراعة الأنسجة ما لوحظ عند زراعة عقل ساقية من البطاطس تحتوي على برعم واحد في غرف مضاءة بلمبات فلورسنت أو لمبات عادية. فكانت النباتات الناتجة باستخدام اللمبات العادية أطول سوقاً وأوراقها أكبر حجماً وأكثر عدداً. وفى العديد من النباتات المنزرعة معمليا يمكن أن ينعكس تأثير الضوء الأزرق عندما يتبع بالضوء الأحمر الذي قد يعطى تأثير مشابه للسيتوكينينات في تكشف الأفرع، لكن بعض الدراسات أثبتت أن بعض النباتات لها استجابة مخالفة لذلك. وللضوء تأثير على عملية تكوين الجذور في زراعة الأنسجة لكن يقع ذلك تحت نظام تحكم فيتوكرومي آخر خلاف النظام المؤثر في تكشف الأفرع. وتوجد صبغات الفيتوكروم في صورتين Pfr والتي تتكسر أثناء فترة الظلام أو التعرض للضوء الأحمر البعيد وتتحول إلى الصورة الأخرى المعروفة بـ Pr. ولوحظ أن النباتات النامية في نهار طويل تحتوي على كمية أعلى من IAA مقارنة بتلك النامية تحت النهار القصير فتعريض مزارع Polianthus tuberosa لطول موجي انجستروم ينشط تكوين الجذور على الأفرع. لكن كانت أحسن ظروف لتجذير نباتات Rhododendron الناتجة من زراعة الأنسجة هو تعريض الأفرع لمدة أسبوعين للأشعة الحمراء البعيدة ثم الأشعة الحمراء لمدة أسبوعين (1993 ,George).

قارن (2003) .Nhut et al تأثير استعمال الضوء الأزرق أو الأحمر مع ضوء الفلورسنت العادي على نمو أفرع مكونة من ثلاث وريقات ناتجة من زراعة أنسجة نباتات الفراولة صنف Akihime حيث زرعت الأفرع في بيئة MS الخالية من السكر وفي جو مشبع بغاز ثاني أكسيد الكربون لحث الأفرع لتكون ذاتية التغذية الضوئية. وتم استعمال مصدر للضوء الأحمر أو الأزرق من النوع (light emitting diodes (LED ، ويمتاز هذا النوع من المصابيح بصغر حجمه وتركيبه الصلب وطول عمره. وكانت الكثافة الضوئية في جميع الحالات ثابتة وقدرها 45 ميكرومول/ م2 / ثانية. وبعد أربعة أسابيع من النمو لم يلاحظ تغيير في طبيعة النمو بين النباتات النامية تحت الأنواع المختلفة من الضوء كما في جدول رقم (3) . ويتبين أن الضوء الخليط من الأحمر والأزرق كان أفضل لنمو النباتات لكن لم يكن هناك فرق معنوي في عدد الجذور عند استعمال أطوال موجية مختلفة.

جدول 3: تأثير نوعية الضوء على نمو أفرع من نباتات الفراولة الناتجة من زراعة الأنسجة (2003 ,.Nhut et al).

* محتوى الكلوروفيل في الورقة الثالثة من أعلى لأسفل مقدرة بوحدات SPAD

هذا وقد أوضح (2002) .Le-Guen Le-Saos et al أن نوعية الضوء المستعملة في غرف النمو لها تأثير على تكوين الأبصال، حيث قام بمقارنة تكوين الأبصال في نباتات Allium cepa تحت ضوء الفلورسنت وخليط مكون من الضوء الفلورسنت وضوء المصابيح العادية والمعروفة باسم Incandescent. وبعد شهر من زراعة الأجزاء النباتية لوحظ أن هناك فروقاً معنوية في الشكل الظاهري بين المجموعتين وازداد هذا الفرق بتقدم عمر المزرعة . ولم يزد معدل التبصيل في النباتات النامية تحت ضوء الفلورسنت عن 2 % أما بعد 30 يوم من النمو في الضوء الخليط ارتفع معدل تكوين الأبصال إلى 89% وأصبحت 100% بعد 90 يوم. وتلازمت الزيادة في معدل تكوين الأبصال بالزيادة في الوزن الرطب والجاف للأبصال وجفت الأوراق تماماً بعد 90 يوما مما يعنى تمام نضج الأبصال المتكونة. وقد وضح تأثير الأطوال الموجية المختلفة على نمو وتكوين الدرنات في البطاطس 2005Seabrook, .

ب- طول الفترة الضوئية

ويقصد بها تعاقب فترة الضوء والظلام خلال الأربع والعشرين ساعة وهي تؤثر في النبات مباشرة إما عن طريق تنظيم كمية الطاقة الضوئية المعرض لها النبات أو عن طريق التأثير في ميكانيكيات أخرى داخل النبات بحيث يدرك بها التغيير في الظروف البيئية. ومن المعروف أن فترة الظلام هي الأهم وليس طول فترة الإضاءة وقد عرض (2005) Seabrook مزارع البطاطس لفترات ضوء ظلام بالطريقة التالية: 16/8 و 4/1 و 1/0.5 بحيث كانت كمية الطاقة الكلية ثابتة خلال اليوم. وكان الوزن الجاف أعلى عند تقصير فترات الإضاءة. لوحظت الاستجابات الآتية للنباتات النامية تحت ظروف طول الفترة الضوئية في مزارع الأنسجة:

* أدى النهار الطويل إلى تكوين عدد أكثر من أفرع Pelargonium وكانت الأفرع أكثر سمكا ووزنا واحتواء على الكلوروفيل بالمقارنة مع تلك النامية في النهار القصير.

* يكون معدل نمو الجذور أفضل في اليوم القصير ولكن هذه الظروف تؤدى إلى الاستطالة الإظلامية للأفرع مما يقلل من نسبة نجاح الأقلمة. وعموماً يمكن التغلب على هذه المشكلة بجعل الجزء المحتوى على البيئة من وعاء الزراعة مظلم وذلك إما بتغطيتها بورق ألومونيوم أو إضافة الفحم النباتي.

* رغم أن نسبة تكشف الأفرع تزداد في اليوم الطويل فإن عدد ساعات الإضاءة الأمثل يختلف من نوع نباتي إلى آخر. وليس من الواضح ما إذا كان هذا التأثير الإيجابي راجعاً إلى عدد ساعات الإضاءة أم إلى ساعات الإظلام.

* لا يتحول الكالس الناتج من أنسجة بعض النباتات مثل نبات Pelargonium إلى اللون الأخضر ولا يتم فيه التكشف في الضوء المستمر لكن يتم التحول إلى اللون الأخضر والتكشف عند التعرض لـ 15 - 16 ساعة فقط ضوء يوميا.

ج. شدة الإضاءة

وتعني الكثافة الضوئية التي تتعرض لها المزرعة وهي مختلفة عن الطول الموجي والفترة الضوئية، وتؤثر شدة الإضاءة على كمية الطاقة الضوئية الكلية التي تستقبلها المزرعة وتلعب الكثافة الضوئية دور هام في تكوين الكلوروفيل في الكالس والأنسجة المنزرعة وبذلك تعتبر عاملا محدد للنمو خاصة في المزارع الذاتية التغذية إذ تزيد شدة الإضاءة من عملية البناء الضوئي. إلا أنه لا يعتمد على عملية البناء الضوئي في زراعة الأنسجة، حيث أن شدة الإضاءة المستعملة في غرف زراعة الأنسجة تكون أقل عشر مرات عن تلك الموجودة في الظروف الطبيعية، وكمية الضوء النافذة خلال الأوعية والأغطية تكون أقل من تلك التي يتم قياسها في غرفة النمو، بالإضافة لاختلاف الطول الموجي للضوء المستعمل عن الضوء العادي. وتجدر الإشارة هنا إلى ضرورة قياس شدة الإضاءة باستمرار في غرف النمو حيث أن شدة الإضاءة الناتجة من لمبات الفلورسنت الشائع استعمالها تنخفض بطول فترة استعمالها. وقد قدر هذا الانخفاض بحوالي 7% بعد 8 أيام و 14% بعد 4 شهور و 30% بعد 12 شهر من الاستعمال. لذا يجب تغيير لمبات الإضاءة على فترت لا تتجاوز الأربعة أشهر.

وقد قام (1995) .Kitaya et al بقياس تأثير شدة الإضاءة التي تصل إلى مزرعة بطاطس ذاتية التغذية الضوئية ولاحظ أن نمو الأشطاء والشكل الظاهري للنباتات يختلف على أساس طريقة وضع مصدر الضوء. والشائع تركيب اللمبات أعلى المزرعة لكن هذه الطريقة ليست هي الأفضل لنمو المزرعة. بل من الأفضل وضع الأوعية في صفوف ووضع اللمبات بجوارها مباشرة وقد لاحظ أن أشطاء البطاطس في هذه الحالة كانت أقصر عن تلك عند استعمال الإضاءة من أعلى. لكن لم ينعكس ذلك على الوزن الرطب والجاف ولا على المساحة الورقية، رغم أن الكثافة الضوئية في داخل الأوعية هذه الحالة كانت أعلى خمس مرات عنها في حالة الإضاءة من أعلى، مع ثبات عدد اللمبات في كلا الحالتين. وقد سجل زيادة في صفات السابقة برفع شدة الإضاءة إلى 90 مكرومول /م2/ ث ثم انخفض النمو بزيادة شدة الإضاءة عن ذلك. لكن لم تشير الدراسة إلى درجة الحرارة داخل الأوعية التي ستتأثر حتما بمكان وضع اللمبات.

ويبين (1987) Economou & Read أن شدة الإضاءة المثلى تختلف باختلاف النوع النباتي، حيث شجع الضوء تكوين الجذور والأشطاء في بعض النباتات بينما ثبط الضوء تكوين الجذور في البعض والراجع لتكسير IAA الداخلي Schneider,2005))، ويشير (2005) Nguyen & Kozai أيضاً إلى أن تأثير الضوء يرتبط غالباً بكمية ثاني أكسيد الكربون المتاحة وكمية السكر بالبيئة. وربما تستجيب الكثير من النباتات إلى زيادة شدة الإضاءة خاصة في المزارع ذاتية أو خليطة التغذية الضوئية، فبرفع شدة الإضاءة إلى 200 زاد عدد الأوراق وكمية الكلوروفيل ومحتوى السكر وصافي عملية البناء الضوئي لنباتات Limonium وكذلك زاد معدل الأقلمة بالمقارنة مع حفظ المزرعة ذاتية التغذية الضوئية عند شدة إضاءة نصف السابقة. لكن لم يتأثر النمو بشدة الإضاءة في المزارع الغير ذاتية التغذية (2002 ,.Lian et al). لكن بزيادة الكثافة الضوئية إلى 210 تسبب التثبيط الضوئي لعملية البناء الضوئي في انخفاض نمو وتكشف أشطاء نباتات Cynara scolymus كما يشير (2005 Schneider). وقد قام (2003) .Nhut et al في نفس التجربة التي سبق الإشارة إليها عند الحديث عن نوعية الضوء بمقارنة ثلاث كثافات ضوئية 45، 60 أو 75 ميكرومول /م2 / ثانية وذلك بخلط 10 % من الضوء الأزرق مع 90% من الضوء الأحمر. وتوضح النتائج المبينة في جدول رقم (4) أن ارتفاع النباتات وعدد الجذور كان أفضل في الكثافة المنخفضة بينما كان عدد الأوراق وطول الجذور والوزن الرطب للنبات ومحتوى الكلوروفيل أعلى في الكثافة الضوئية المتوسطة.

جدول 4: تأثير الكثافة الضوئية على نمو أفرع من نباتات الفراولة الناتجة من زراعة الأنسجة.

* محتوى الكلوروفيل في الورقة الثالثة من أعلى لأسفل مقاس بوحدات SPAD

وفي عدة دراسات لتأثير شدة الإضاءة على مزارع الأنسجة اشار George (1993) إلى التأثيرات الآتية:

* أدت شدة الإضاءة إلى تثبيط نمو الكالس في بعض أنواع Pelargonium بسبب زيادة إنتاج المواد الفينولية وتثبيط تخليق الهرمونات.

* تحتاج أصناف محددة من Chrysanthemum دون الأصناف الأخرى إلى كثافة ضوئية عالية لتكوين أشطاء. وبعض الأصناف تحتاج إلى كثافة عالية في البداية ثم كثافة منخفضة.

* يتطلب تكوين البراعم الزهرية في أغلب النباتات كثافة ضوئية عالية بالإضافة إلى أهمية الفترة الضوئية.

7. المجال الكهربائي والمغناطيسي

لقد نال تأثير المجال المغناطيسي والكهربي المغناطيسي electromagnetic field (EMF) سواء الثابت أو المتردد وبالأخص ذو التردد العالي اهتمام بعض الباحثين في مجال زراعة الأنسجة في الآونة الأخيرة، وذلك لما عرف من تأثيره المتباين على النباتات والحيوانات والكائنات الدقيقة (2007 ,.Atak et al). ومن الثابت أنه يؤثر على إنبات الكثير من البذور ونمو البادرات (1993) .Ruzic et al وقد سجل الكثير تأثيراته الايجابية على النمو والإنتاج للعديد من المحاصيل. فقد وجدSingh et al., (1996)  تغيير في تركيب الماء عند تعريض لمجال مغاطيسي كهربي قوته Hz50 وبذلك تحدث تغييرات مورفولوجية وسيتولوجية في الخلايا. وأشارت أبحاث كثيرة الى أن EMF يغير من خواص الغشاء الخلوي ونفاذيته للأيونات وبالتالي تجميعها داخل الخلية ومن ثم تأثيرها على الضغط الأسموزي، والتعبير الجيني، وتخليق البروتين، ونشاط الإنزيمات، والعديد من عمليات الأيض (1992) .Phillips et al وStange et al., 2002 و 1999 ,.Hirota et al) و (2008 ,.Racuciu et al). لكن رغم اثبات البعض تأثير المجال المغناطيسي على مزارع الأنسجة فإن التفسير الدقيق لذألك لم يحدد بشكل تام (2009) .Dao-liang et al) .

ويشير (2007) .Atak et al أن الدراسات السابقة بينت حدوث تغيير في طول مرحلة التهيؤ الأول G1 للخلايا الميرستيمية عند تعريضها لمجال مغناطيسي. وتزامن ذلك مع معدل عالي من تخليق البروتين و RNA وقد قدرت عدد الإنزيمات التي تأثرت في تلك الدراسات بحوالي 50 إنزيم من بينها تلك المنوط بها تكوين الشوارد الحرة أثناء تفاعلات الهدم وأخرى مثل البيروكسيدز المعروف بدورة في مقاومة الإجهاد الملحي والمائي. ولا يتوقف دور البيروكسيدز عند هذا الحد بل لها علاقة غير مباشرة بالتكشف في مزارع الأنسجة من خلال تأثيرها على أيض الأوكسينات والسيتوكينينات (2007) .kose. إلا أنه بتعريض معلق خلايا الدخان في مرحلة النمو اللوغارتمي لمجال مغناطيسي ثابت شدته mT10 أوmT  30 لمدة خمس ساعات في اليوم وقف نمو الخلايا وزاد معدل الموت وتزامن ذلك مع نشاط إنزيم البيروكسيدز وتكوين اللجنين في الخلايا 2007 Abdolmaleki et al) .

زرع (2009) .Dao-liang et al العقد الساقية لأشجار Prunus maritime بعد تعرضها لمدة عشر دقائق لمجال مغناطيسي يتراوح بين 48 و 155 كيلو أمبير/دقيقة. ووجد أن تعريض العقد الساقية لمجال شدته 97 ضاعف معدل تكشف الأشطاء لكن انخفض عدد الأشطاء عند زيادة شدة المجال عن 97. وبالمقارنة مع الشاهد ارتفع معدل التكشف 3.2 ضعف حيث وصل عدد الأشطاء إلى 17 لكل مُستأصل نباتي عند التعرض لمجال شدته 97. ولم يتوقف الأمر عند ذلك بل كان للمعاملة تأثير ايجابي على وزن وطول الأشطاء والجذور. ومن الجدير بالذكر أن النسبة بين الوزن الرطب والجاف للأشطاء توضح ثبات معدل امتصاص الايونات رغم زيادة امتصاص الماء عند التعرض للمجال المغناطيسي. درس .Rakosy-Tican et al (2005) تأثير تعريض مزارع العقد الساقية والقمم النامية لصنف البطاطس Desiree لفترات مختلفة وفى مواعيد مختلفة من عمر المزرعة لمجال مغناطيسيي ضعيف جدا. وقد تباين التأثير بين تثبيط وتشجع لنمو الأوراق والسوق والجذور على أساس مدة التعرض للمجال هل 14 أم 28 يوم. وقد تأثير محتوى الأوراق من صبغات البناء الضوئي. وقد لاحظ أيضا اختلاف في معدل نمو الأوراق على العقد الساقية لأجناس البطاطس البرية Solanum chacoense و S. microdontum و S. verrucosum عقب تسعة أيام من التعرض للمجال إلا أن عدد القمم الميرستيمية في المستأصل والمغناطيسية الأرضية geomagnetic كان ذو تأثير معنوي في استجابة المزرعة.

كما اهتم البعض بدراسة تأثير المجال المغناطيسي والذي قد يتولد طبيعياً نتيجة مرور التيار الكهربي في غرف النمو أو بوضع المزارع داخل مجال مغناطيسي. فلا يقف تأثير الإضاءة الموجودة في غرف النمو على النمو والتكشف بفعل الضوء فقط لكن يتولد من ملحقات لمبات الفلورسنت وهي الأكثر شيوعا في الاستخدام مجالا مغناطيسيا. وتتفاوت شدة هذا المجال عند الأرفف المختلفة في غرف النمو على أساس القرب أو البعد عن المصدر. وأدى التعرض لمجال مغناطيسي كهربي إلى زيادة الأفرع ونسبة التجذير وطول الأشطاء ووزنها في نباتات Prunus cerasifera وزاد عدد الأشطاء والجذور في نباتات Aloe arborescens. ولوحظ انخفاض في عدد الأجنة الجسدية المتكونة وكذلك نسبة إنباتها في Quercus uber عند وضعها في مجال ضعيف قدره MT 15، Hz  50 ويتوقف مدى هذا الانخفاض على التركيب الوراثي المستعمل. وقد أرجع ذلك إلى تأثير المجال الكهربي على القطبية ( ,.Celestino et al 1998).

وفي بعض الدراسات وجدت زيادة كبيرة في نمو الكالس الناتج من زراعة أنسجة نبات الدخان عند تمرير مجال كهربائي ضعيف شدته 1 ميكروامبير بين الأنسجة المنزرعة والبيئة. ويتوقف هذا التأثير على موقع الطرف السالب والموجب للتيار فعندما جعل الكالس ناحية القطب السالب زاد نموه بمقدار 70% وعند عكس اتجاه التيار كانت الزيادة قليلة جداً.