لا بد من سلسلة العديد من الببتيدات المتداخلة

لا تكفي سلسلة كل القطع الناجمة عن شطر البروتين بالكاشف CNBr للحصول على كامل المعلومات المطلوبة لتحديد بنيته الأولية بشكل تام، ويعود ذلك لعدم وجود أية معلومات عن ترتيب هذه الببتيدات ضمن البروتين المسلسل. وللوصول إلى هذه البنية لا بد من تحضير قطع ببتيدية أخرى تتداخل نهاياتها الأمينية والكربوكسيلية مع قطع CNBr وذلك باستعمال بعض الطرائق (مثل الهضم بالكيموتربسين) التي تشطر البروتين في أماكن غير ثمالات الميثيونين، ثم سلسلتها. بعد ذلك، وبمقارنة السلاسل الببتيدية المتداخلة، يمكن استنتاج البنية الأولية دون لبس، وهي العملية الشبيهة بحل لغز الصور المقطعة (الشكل 5-12).

ولتحديد مواقع الروابط ثنائية السلفيد، يجري فصل الببتيدات من البروتين غير المعالج والبروتين المرجع (المختزل) أو المؤكسد بواسطة الاستشراب ثنائي البعد أو الرحلان الكهربي والاستشراب (البصم: Fingerprinting). ويبدي الإظهار بالنينهيدرين ببتيدات أقل في هضامة البروتين غير المعالج وببتيدات إضافية في هضامة البروتين المعالج. ومع معرفة البنية الأولية لهذه الببتيدات، يمكن الاستدلال على مواضع الروابط ثنائية السلفيد.

الشكل 5-11: تفاعل «إدمان». يشتق تفاعل فينيل إيزوثيوسيان الثمالة الأمينية النهائية للببتيد على شكل حمض فينيل ثيوهيدانتويك، ثم تؤدي المعاملة مع حمض في مذيب غير هيدروكسيلي إلى تحرير الفينيل هيدنتوين، والذي يمكن تمييزه بعد ذلك بحركيته الاستشرابية، وبظهور ببتيد أقصر بثمالة واحدة؛ وتكرر العملية فيما بعد.

الشكل 5-12 : يستعمل الببتيد المتراكب Z لاستنتاج أن الببتيدين y و  X  موجودان في البروتين الأصلي بالترتيب xy  وليس العكس