هناك عدة طرائق مختلفة تستخدم من خلالها تقدير الأوزان الجزيئية للبروتينات وهذه البروتينــــات قــــد تصنف البعض منها إنزيمات أو هورمونات وكذلك يمكن استخدام هذه الطرائق أيضاً لتقدير الأوزان الجزيئية للببتيدات وفيما يأتي وصف لهذه الطرائق المستخدمة:

1- تقدير الوزن الجزيئي بطريقة الترشيح الهلامي Gel filtration

يتميز الترشيح الهلامي كما ذكر سابقاً بكونه غربالا جزيئياً يمكنه فصل المركبات عن بعضها بالاعتماد على وزنها وحجمها الجزيئي وان الوسط المستخدم الطور الصلب عبارة عن هلام الذي يكون علــى عدة انواع منها السيفاديكس Sephadex وكذلك البايوجيل Biogel وهذه الأنواع تتميز بكونهــا تـــــوي على ثقوب أو مسامات يمكن من خلال هذه الثقوب دخول الجزيئات ذات الأوزان الجزيئية الصغيرة التي تكون حجمها أصغر من الثقوب وبالتالي سوف تخرج هذه الجزيئات مع السائل الذي يسمى الحجـــم الداخلي (Internal volume (Vi حجم السائل داخل دقائق (الهلام والذي غالباً يتأخر عن خروجه من عمود الفصل، اما الجزيئات التي لا تدخل ثقوب حبيبات الجيل (الجزيئات الكبيرة) فأنها سوف تخــرج أولاً من العمود مع السائل الذي يسمى الحجم الخالي (​ Vο​) Void volume حجم السائل خارج دقائق الهلام) ولهذا فأن:

مجموع حجم السائل الكلي للعمود الفصل=حجم السائل خارج الدقائق + حجم السائل داخل الدقائق

ولمعرفة الوزن الجزيئي من خلال تقنية الترشيح الهلامي يتم في البداية رسم المنحني القياسي لعددٍ مـــــن البروتينات المعروفة الأوزان الجزيئة يفضل ان تكون ضمن مدى البروتين المجهول) بـيـن حجــوم روغانها من تقنية الترشيح الهلامي مقابل لوغاريتم أوزانها الجزيئية ومن تسقيط حجم الروغـــــان للمــــادة المراد تقدير وزنها الجزيئي بعد إمرارها على نفس العمود المستخدم في إمرار البروتينات المعروفة الأوزان الجزيئية وتحت نفس الظروف يمكن إيجاد الوزن الجزيئي للمادة المجهولة بصورة تقريبية ويطلق عليه اسم الوزن الجزيئي التقريبي أو بالمقارنة Comparative molecular weight. (لاحظ الشكل 24-13).

ومن الرسم أعلاه يمكن إيجاد حجوم الروغان لخليط المركبات القياسية المستخدمة وحجم الروغان للمركب المراد إيجاد وزنه الجزيئي ثم رسم المنحني القياسي بين الأوزان الجزيئية (ويستخدم عادة لوغاريتم الأوزان الجزيئة) (الشكل (25-13 ) للمركبات المعروفة الوزن الجزيئي وحجوم روغانها للحصول على خط مستقيم وكما يأتي:

وبعد ذلك يمكن إيجاد الوزن الجزيئي للمركب المجهول بعد تسقيط حجم روغانه على المنحني القياسي.

2- قياس الوزن الجزيئي من سرعة التركيد Sedimentation velocity

يمكن تقدير الوزن الجزيئي للبروتين باستخدام جهاز الطرد المركزي ذي السرعة الفائقة Ultracentrifugation وتعتمد الطريقة على تركيد البروتينات ذات الأوزان الجزيئية العالية بـصورة أسرع من ذات الأوزان الجزيئية الواطئة. وتستخدم المعادلة الآتية لتقدير الوزن الجزيئي للمركب:

اذ تمثل:

S = معامل التركيد (الترسيب).

R = ثابت الغاز ( 10⁷× 8.314  ارك/ مول. درجة).

T = درجة الحرارة المطلقة.

D= معامل الانتشار سم²/ ثانية والتي تساوي كمية المركب الذي ينتشر بالثانية خلال مساحة قدرها واحد سم² بوحدة تركيزية متدرجة (واحد مول).

= V الحجم التفاضلي للمركب.

ρ= كثافة المذيب Sedimentation coefficient.

3- تقدير الوزن الجزيئي بطريقة الهجرة الكهربائي من نوع SDS

ان مركب كبريتات دوديكايل صوديوم SDS له القابلية على فصل وحدات Subunits البروتينات الى وحدات ثانوية بارتباطه معها بقوة وبالتالي يزيل الشحنة الأصلية الموجودة على البروتين. يتجه البروتين المرتبط بـ SDS الى القطب الموجب بالاعتماد على نسبة الشحنة الى الكتلة وعندما تتم الهجرة الكهربائية على هلام الأكريل أميد المتعدد باستخدام SDS فأنه يتحرك أيضاً اعتماداً على حجمــــه. وكما ذكر سابقاً فأن حركة البروتينات خلال الهجرة الكهربائية نحو القطب الموجب باستخدام SDS تعتمد على عدة عوامل من ضمنها الوزن الجزيئي عند ثبوت العوامل الأخرى من الشحنة والتيار الكهربائي وغيرها) وبالتالي سوف تتحرك البروتينات بمسافات مختلفة من بداية وضع العينة في الهلام لجهاز الهجرة الكهربائية إذ يعطي كل بروتين مسافة معينة تقاس بالسنتمترات (سم) وبنفس الوقت يتم إمرار محاليل قياسية حاوية على بروتينات معلومة الوزن الجزيئي ومن خلال رسم المسافات التي تقطعها المركبات البروتينية المعروفة الوزن الجزيئي مقابل لوغاريتم أوزانها الجزيئية يمكن إيجاد الوزن الجزيئي للمركب المجهول بعد تسقيط المسافة التي يقطعها على المنحني القياسي وكما في الشكل (26-13) الأتي:

وبنفس الطريقة السابقة في الترشيح الهلامي يتم إجراء عملية التسقيط.

4- قياس الوزن الجزيئي بطريقة الضغط الأرموزي

عندما يفصل المحلول عن المذيب النقي بوساطة الغشاء النافذ للمذيب وليس الى المذاب تتحرك جزيئات المذيب خلال الغشاء الى المحلول، ويسمى الضغط الذي يجب استعماله لمنع مرور جزيئات المذيب بالضغط الأزموزي π  . ويعتمد هذا الضغط على تركيز المذاب ودرجة حرارة المحلول، ويمكن قياس الوزن الجزيئي للمذاب (البروتين) من قياس الضغط الأزموزي π  وبالمعادلة الآتية:

إذ تمثل:

T = درجة الحرارة المطلقة

R = ثابت الغاز (0.0821 لتر / جو / مول - درجة مطلقة)

wt = وزن المذاب (غم)

M.wt = الوزن الجزيئي

V =الحجم (لتر)

 π = الضغط الأزموزي.

مواضيع ذات صلة

محلل الأحماض الأمينية التلقائي Automated amino acid analyzer

استخلاص وتنقية البروتينات Isolation and purification of proteins

الكالموديولين Calmodulin

الكارنيتين Carnitine

حامض الليبويك Lipoic acid

حامض البانتوثينك Pantothenic acid

حامض الفوليك Folic acid (الفولاسين Folacin)

تراكيب الأحماض النووية

تقدير البروتين Protein determination

تغيير الحالة الطبيعية للبروتين (المسخ) Denaturation

ذوبانية البروتينات Solubility of proteins

بروتينات البلازما Plasma proteins