طرق حفظ الاصول الوراثية باستخدام تقنية زراعة الانسجة

ان الاصول او المصادر الوراثية النباتيةgenetic resources  هي الاساس البيولوجي الغذائي الامن في العالم وهي مجموعة بذور او اجزاء نباتية وقد تكون الخلايا او الانسجة الممثلة لمصدر وراثي نباتي معين والذى يحمل بدوره كل صفاته الوراثية المميزة والخاصة به.

وتدعم المصادر الوراثية بصورة مباشرة او غير مباشرة سبل معيشة الانسان فهي المادة الخام المستخدمة في انتاج الاصول والسلالات الجديدة وتمثل مستودعا للتكيف الوراثي الذي يعمل كحاجز ضد التغيرات البيئية ويشكل تأكل هذه الموارد تهديدا خطيرا للأمن الغذائي في العالم على المدى الطويل.

ان حفظ المادة الوراثية على صورة بذور في البنوك الجينية gene banks تحت درجة حرارة منخفضه هي اوسع الطرق انتشارا حيث ان هذه البذور تشغل مساحة صغيرة وكذلك نقلها وتجميعها بسهوله من اماكن تواجدها. ولكن هذه الطريقة للحفظ على صورة بذور قد تواجه العديد من الصعوبات منها فقد الحيوية للبذور مع طول فترة التخزين ولا يمكن تطبيقها على المحاصيل التي تتكاثر خضريا مثل البطاطس والموز والكاسافا والفراولة والبطاطا.

وعلى سبيل المثال يتم حفظ سلالات واصناف البطاطس التي هي من المحاصيل المتكاثرة خضريا حيث انها من المحاصيل منخفضة الخصوبة كما ان البذور التي تنتجها تحت ظروف خاصة ينتج عنها نباتات غير مشابهة للإباء. ونظرا لعدم وجود طريقة تقليدية للحفاظ على هذه السلالات والاصناف سوى الاكثار السنوي لها خضريا في الحقل مما يمثل ارتفاعا للتكلفة وربما ايضا تعرضها للآفات والامراض. ثم ايضا ان تخزين السلالات عن طريق استمرار اعادة الزراعة Subculture معمليا فقط لمدة طويلة له بعض العيوب منها خطورة فقد هذه السلالات نتيجة الخطأ البشرى في الحفاظ على هذه الانسجة داخل المعمل او عن طريق التلوث العرضي للزراعات. ايضا عدم الثبات الوراثي حيث انه يظهر اثناء الزراعة المتكررة. لوحظت هذه العيوب خاصة في خلايا البروتوبلاست والانسجة غير المتكشفة مثل الخلايا المفردة والكالوس. وتتراوح التغيرات الوراثية ما بين اضافة او نقص تتابع جين معين. قد يرجع ذلك الى ضغط ظروف التخزين او اثناء النمو على بيئة زراعة الانسجة.

يناط بنوك الجينات في مراكز الابحاث الدولية والاقليمية والوطنية الابقاء علي السلالات النباتية والحيوانية وخاصة المحلية منها بصورة نقية ومحتفظة بحيويتها وايضا تصنيف هذه السلالات ويتم الاحتفاظ بسجلات لها كما يمكن لهذه البنوك تبادل هذه المصادر الوراثية بين مراكز الابحاث ومختبرات التربية القائمة على تحسين السلالات والاصناف والطرز المختلفة. وتجدر الاشارة الى ضرورة الاستمرار في حفظ جميع السلالات حتى ان لم يجد مربو النبات فيها من الصفات التي يرغبون في ادخالها ضمن برامج التربية للأصناف، ذلك لان ما قد يعتبر عديم القيمة حاليا قد تكون له اهمية كبيرة في المستقبل.

الجدير بالذكر ان حفظ الاصول الوراثية النباتية للنباتات البرية والزراعية، باستخدام تقانات زراعة الانسجة وباستخدام منفصلات نباتية مختلفة مثل الانسجة المرستيمية كالبراعم الجانبية والقمه النامية او حبوب اللقاح او الاجنة الجسمية في بنوك الجينات يلعب دورا فعالا وحيويا للمحافظة على الانواع النباتية البرية، وبشكل خاص النباتات النادرة والمهددة بالانقراض، وكذلك الحال بالنسبة لكثير من المحاصيل الزراعية الهامة وخاصه السلالات المحلية، والتي قد تكون عرضة للإصابة بالعديد من الامراض الفطرية والفيروسية والآفات وغيرها، مما قد يؤدي الى اندثارها والمثال الواضح اختفاء بعض الاصناف المحلية المصرية من الفراولة والمشمش والشمام وكثير من النباتات الطبية.

حفظ الانسجة في المعمل (In-vitro conservation)

لقد امكن استخدام تكنولوجيا زراعة الانسجة وذلك لأنواع النباتات ذات التكاثر الخضري او للأنواع التي تنتج بذورا تابعة لمجموعة الريكالسيترانت (recalcitrant Seeds) وهي البذور التي لا يمكن حفظها بطرق الحفظ العادية وغالبا ما تحفظ في بنوك جينات حقلية كمجموعات وراثية حقلية ومن امثلة هذه بذور نباتات الشاي والمانجو. ويتم حفظ الانسجة في المعمل تحت ظروف حفظ متوسطة المدى حيث يؤدي الى نموات بطيئة للأنسجة على بيئة متدنية الاحتياجات الغذائية minimal growth medium وفي تلك الحالة يتم تجديد او نقل المزارع Subculture الى بيئات طازجة كل عدة اعوام كما يمكن استعادة الحيوية للأنسجة المحفوظة بهذه الطريقة ,Dodds et al. 1984a Mullen and Schiegel, 1979

اما الحفظ تحت ظروف طويلة المدى فيتم بتخزين المواد الوراثية النامية باستخدام طريقة زراعة الانسجة وذلك في سائل النيتروجين مباشرة او بعد التجفيف الجزئي للأجزاء النباتية قبل وضعها في سائل النيتروجين وتشير النتائج الى امكانية الحصول على نتائج ناجحة في عديد من النباتات وحفظها لعشرات الاعوام وايضا استعادة حيوية الانسجة بنسبة كبيرة Seibert and Wetherbee, 1977, Kartha ,1981 and 1982

وعلى العموم هناك مميزات للحفظ بالطريقة المعملية باستخدام تقانات زراعة الانسجة سواء كان الحفظ تحت ظروف طويلة المدى او متوسطة المدى اهمها:

1- استخدام مساحة معملية صغيرة للمحافظة على اعداد كبيرة من النباتات المتكاثرة خضريا.

2- الحفاظ على المادة الوراثية والنباتات تحت ظروف خالية من الملوثات وبعيدة عن مصادر الاصابة المرضية او الحشرية.

3- الحماية من الظروف المناخية غير المناسبة والتي تسبب هلاكا للسلالات النباتية احيانا.

4- سهولة اكثار النويات الصغيرة لإنتاج اعداد كبيرة من النباتات عند الحاجة اليها في اي وقت (الاكثار الدقيق micropropagation).

5- تسهيل مهمة نظام الحجر الزراعي حيث ان هذه الانواع موجودة وتنقل تحت ظروف تعقيم كاملة، مما يساهم في عدم انتشار الامراض بين الدول المختلفة.

حفظ متوسط المدى Midterm storage

وهو الحفظ باستخدام بيئة النمو البطيء minimal growth medium وقد ذكر (1980 .Henshow et al)، طريقة حفظ بعض اصناف وسلالات البطاطس كما يلى:

– تنقل العقل الساقية المزروعة في بيئة الاكثار الى بيئة سائله تحتوي على املاح MS وتخفض درجة الحرارة الى 6 – 12 م مع اضافة 3-6٪ مانيتول الى البيئة وزيادة السكر الي ٪۸.

– وايضا اضافة 1/2- 10 ملليجرام من حمض ابسسيك ABA والجدول التالي يوضح استعادة حيوية العقل الساقية بعد فترات التخزين احداهم سلالة برية للبطاطس ويتضح انه كلما زادت فترة التخزين قلت حيوية العقل الساقية وايضا ان هناك اختلافات بين الاصناف والسلالات.

جدول يوضح النسبة المئوية (%) لاستعادة نشاط العقل الساقية لبعض اصناف وسلالات البطاطس بعد عملية الحفظ (1980. Henshow et all)

استخدمت ايضا هذه الطريقة(midterm storage)  في دراسة لثلاثة اصناف من الفراولة حيث تم زراعة المرستيمات على بيئة تحتوي على املاح اساسية (Knob Salts) بالاضافة الى منظمات النمو وتركيزات مختلفة من السكروز (صفر – 60 جرام / لتر). وقد اظهرت النتائج امكانية حفظ اصناف الفراولة حتى 12 شهرا واستعادة حيوية النباتات بنسبة مئوية تزيد عن 50 ٪ وذلك تحت درجة حرارة 5 م وتحت اظلام تام وبتركيز سكروز يصل الى 30 جرام / لتر Hassan and Ragab, 2006)) وفي دراسة  مشابهة استخدمت مدادات الفراولة صنف كماروزا بطول ۲-۳ سم ثم تم عزل المرستيمات وزرعت على بيئة مغذية للحصول على زراعات خالية من التلوث تلي ذلك نقلها الى بيئة الحفظ Knop medium مع اضافة 0.1 ملليمول سوربيتول وقد امكن حفظ الافرع لمدة 15 شهرا وتم استرجاع ٦٧٪ من هذه الافرع بصورة جيدة ولم تظهر اختبارات البصمة الوراثية RAPD اي اختلافات وراثية في الناتج بعد الحفظ Hassan and Bekheet 2008 وتختلف الاستجابة للحفظ تبعا للنوع النباتي بل ايضا للصنف المستخدم، فقد اختلفت نباتات الثوم في القدرة على الحفظ، فالصنف البلدي اكثر قدرة من الاصناف الاخرى التي تم اختبارها، كذلك اختلفت الاستجابة لإضافة السوربيتول لاحد الاصناف، بينما اضافة السكروز كان هاما في الصنف الاخر وقد امكن الحفظ لمدة ١٨ شهرا تحت درجة حرارة 4 م وتحت اظلام كامل وامكن استرجاع النشاط الحيوي للنباتات المحفوظة تحت هذه الظروف بنسبة 100 ٪ (2007 .Hassan, et al).

ومن ناحيه اخرى، فان التخزين لفترة طويلة للأجنة يعطى فرصة اكبر للثبات الوراثي وهو احد المتطلبات الاساسية في الحفاظ على الاصول الوراثية، فقد امكن حفظ الاجنة الجسمية لنخيل البلح في بيئة متدنية الاحتياجات الغذائية لمدة متوسطةا لمدى Hassen et al 2004. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في محاصيل اخرى مختلفة كما تذكر المراجع (Lundergan and Janick, 1979, Mullen and Schiegal 1979, Kartha, 1981)  

مع ملاحظة ان المحافظة على المادة الوراثية في صورة نباتات معملية كاملة ومن ثم اكثارها بواسطة استخدام قطع السلاميات يقلل كثيرا من فرص التعرض لعدم الثبات الوراثي بعكس الاكثار عن طريق نسيج الكالوس حيث يسمح بوجود نسبة من التغيرات.

الحفظ في النيتروجين السائل (Cryopreservation)

عندما يستخدم سائل النيتروجين للحفظ تسمى بطريقة الـ Cryopreservation. ويمكن بهذه الطريقة حفظ الاجزاء النباتية بما فيها البذور، معلق الخلايا، كالوس، حبوب اللقاح، النموات الطرفية وذلك اما بوضعها في السائل نفسه او تعريضها للأبخرة الصاعدة منه. بغرض الحفظ طويل المدى.

المبدأ الأساسي في الحفظ بالتجميد هو وضع الخلايا والانسجة النباتية والاعضاء في درجة حرارة منخفضة جدا تصل الى –196 درجة تحت الصفر في وجود حماية من التجميد للمادة النباتية. في هذه الطريقة يقل نشاط الخلايا الى حد التوقف عن عمليات الايض والتمثيل الغذائي وما يشمله من نشاط الانزيمات المختلفة. ان نجاح طريقة الحفظ بالتجميد ادى الى زيادة الحماس لاستخدامها لحفظ الاصول الوراثية لفترات طويلة للمحافظة على الانواع الوراثية الجيدة والمتباينة.

ادخلت هذه التقنية للاستخدام في النباتات منذ عام ١٩٧٥ حيث انه امكن استعادة نباتات من الخلايا او الاجنة او حتى القمم المرستيمية المجمدة بتلك الطريقة لمدة غير محددة من الوقت.

استخدمت تلك التقنية على نطاق واسع على عدد كبير من الانواع النباتية على سبيل المثال، النخيل(Hamed et al., 2003 „Gabr et al 2008)  ، البطاطا (1990Lazzaraga et al) البطاطس (Dodds et al. 1984a)، الفراولة والقمم المرستيمية للبسلة (Kartha , 1982).

وهناك مميزات عدة لاستعمال هذه الطريقة في الحفظ وهى:

1) نظرا لدرجات البرودة شديدة الانخفاض، فان ثبات المكونات الكيماوية والوراثية يظل قائما لمدد طويلة اثناء الحفظ.

2) الحاجة الى تجديد حيوية المواد الوراثية تقل الى حدود دنيا.

3) سهولة استخراج المواد الوراثية من اماكن حفظها عند لزوم استخدامها.

ولكن كثير من المواد الوراثية النامية باستعمال طريقة زراعة الانسجة تكون حساسة عند تعرضها لإجراءات الحفظ ودرجات التجميد واثناء اعادة اذابة الاجزاء المجمدة. ويتوقف مقدار هذه الحساسية تبعا لأنواع المواد الوراثية المستخدمة. ويحتاج العمل في هذا المجال واستخدام تلك التقنية الى مهارات خاصة لابد من توافرها في القائمين على العمل. فمن الضروري معرفة ان الخلايا المجمدة لابد من حمايتها من حروق وجروح التجميد اثناء عملية التجميد نفسها وايضا تكون بلورات الثلج داخل العضو او الخلايا والذي قد يؤدي الى فقدان تلك الخلايا لحيويتها ويكون مصدرا اخر من عوامل تحطم الخلايا. ايضا الزيادة في التركيز للمواد الذائبة البين خلوية الى حد السمية. والخلايا ايضا يمكن ان تعاني من فقدان الحيوية نتيجة فقد المواد الذائبة الضرورية اثناء عملية التجميد. ايضا الحالة الفسيولوجية للمواد النباتية التي سوف تدخل عملية التجميد تؤثر كثيرا على حيوية المادة المجمدة.

حساسية الخلايا لدرجة الحرارة المنخفضة تتوقف على النوع النباتي. فمثلا نظرا لكبر حجم بذور مجموعة الريكالسيترانت بصفة عامة فان حفظ محاور الاجنة في سائل النيتروجين له افضلية. الطريقة العامة هي وضع الخلايا في الوسط الغذائي مع توفير مادة للحماية من التجميد.

هناك عدة طرق تطبيقية للحفاظ على الانسجة والخلايا اثناء الحفظ في سائل النيتروجين عند درجة حرارة متدنية تصل الى (١٩٦) درجة مئوية تحت الصفر. وتشمل طريقة التجميد البطيء او التدريجي او السريع.

– طريقة التجميد البطيء

في هذه الطريقة تجمد الخلايا بطريقة بطيئة اولا على درجات حرارة منخفضة بسرعة تتراوح ما بين 5 الى 4م لكل دقيقة بداية من درجة الصفر حتى تصل درجة الحرارة الى - 100م، تنقل بعد ذلك الى النيتروجين السائل، وهذه الطريقة مفضلة خاصة في المزارع السائلة للخلايا.

– طريقة التجميد التدريجي

في هذه الطريقة تبرد العينة النباتية تدريجيا الى ان تصل الى درجة متوسطة وتحفظ على هذه الدرجة لحوالي 30 دقيقة وبعد ذلك تبرد بسرعة عن طريق وضعها في النيتروجين السائل مباشرة. يمكن استخدام التجميد التدريجي في حفظ العديد من المواد النباتية بمدي واسع اعتبارا من المزارع السائلة للخلايا، القمم المرستيمية، البراعم القمية. عند التجميد بتلك الطريقة تتكون بلورات الثلج خارج العينة النباتية.

– طريقة التجميد السريع

استخدم 1977 ,Seibert and Wetherbee طريقة مغايرة للتجميد السريع حيث قاما بتجميد قمم البراعم الابطية عن طريق صب النيتروجين السائل على الوعاء المراد تجميده اولا ثم بعد ذلك يحدث غمس لذلك الوعاء في النيتروجين السائل. اظهرت القمم النامية لنبات القرنفل المعاملة بتلك الطريقة والمحفوظة على درجة - ١٩٦ م امكانية المحافظة عليها لمدة شهرين وكانت حية وامكن استعادة النباتات منها عند الزراعة.

طريقة حفظ القمة النامية للبطاطس في النتروجين السائل Cryopreservation

عند استخدام الحفظ تحت النيتروجين السائل هناك عوامل تؤثر على الحفظ بالتجميد للمرستيمات وزراعات الخلايا كما اشار (1982 , Kartha) منها:

1- الحالة الفسيولوجية للخلايا قبل الحفظ.

2- نوع مادة الحفظ Cryoprotectants.

3- معدلات التبريد.

4- درجة الحرارة التي تم الوصول اليها قبل الوضع في النيتروجين السائل.

5- درجة حرارة الحفظ للأنسجة.

6- ازاحة التبريد (الاسالة) thawing وطريقة الاستيلاد regeneration للخلايا غير المتكشفة.

تتلخص طريقة حفظ القمة المرستيمية لنبات البطاطس تحت ظروف الحرارة المتدنية باستخدام النيتروجين السائل على سبيل المثال فيما يلى:

1- عزل القمة المرستيمية لنبات البطاطس تحت شروط التعقيم والتي تحتوي على القمة النامية وزوج من الاوراق الاولية ويمكن استخدام البراعم الابطية من النباتات النامية في الصوبة.

2- تنقل الى بيئة MS سائلة تحتوي على 1 ملليجرام BA وتحضن لمدة يومين على درجة حرارة ٢٢ درجة مئوية.

3- تنقل الى البيئة المضاف اليها محلول 10% (DMSO)dimethyl sulphoxide.

4- تنقل الى النيتروجين السائل مباشرة على طرف ابرة وتحزن لفترة طويلة.

5- في حالة استرجاع حيوية هذه المرستيمات تنقل مباشرة الى بيئة عند درجة حرارة 34 م وذلك لتخفيف تأثير مادة DMSO ثم تنقل بعد ذلك الى ورق ترشيح على هيئة كوبري في بيئة نمو ملائمة. (انظر الشكل السابق) يحفظ النموات عند درجة ۲۲ م وتحت نظام اضاءة مستمر قدرها (4000 lux).

ولنجاح هذه الطريقة هناك اعتبارات يجب مراعاتها مثل العمر الفسيولوجي للنسيج والحجم المستخدم، ايضا التركيب الوراثي (صنف وسلالة النبات) والمحتوي المائي للنسيج.

وقد نجحت هذه الطريقة في بعض اصناف البطاطس بنسبة تتراوح بين 5-40% لاسترجاع واعادة الحيوية للأنسجة المحفوظة تحت ظروف الحرارة المتدنية باستخدام النيتروجين السائل.

استخدمت طريقة الحفظ بالنيتروجين السائل في حفظ النباتات المعملية plantlets وايضا الكالوس الجنيني لنخيل البلح للأصناف الجافة المصرية والتي تتميز بها محافظة اسوان كما امكن الحصول على نباتات طبيعية من هذا الكالوس واقلمتها في الصوبات الزراعية (2008 .Gabr et al). كما امكن حفظ الكالوس الجنيني لنخيل البلح للأصناف نصف الجافه من واحه سيوه في صحراء مصر الغربية باستخدام تقنية النيتروجين السائل (Ibrahim et al., 2008)

ومن المعتقد ان هذه التقانات والابحاث الحديثة سوف تسهم بنصيب وافر في المحافظة وتوثيق اهم تراث نباتي في المنطقة العربية للأجيال القادمة ومن اهمها نخيل البلح.

ذكر (1997 .Blakesley et al) طريقة بسيطة للمساعدة على حفظ واسترجاع النسيج الجنيني لنباتات البطاطا وذلك باستخدام تركيزات من السكر قبل الحفظ في النيتروجين السائل.

يمكن ايضا حفظ حبوب اللقاح لأنواع نباتية معينة وذلك بعد تجفيفها وتخزينها في درجات حرارة تحت الصفر المئوي او في سائل النيتروجين. وتتميز هذه الطريقة بسرعة وسهولة الحصول على المادة الوراثية، وتتمثل عيوب هذه الطريقة في قصر استعمالها للمواد النباتية المذكرة فقط الا ان تلك المواد النباتية هامة جدا لبرامج تربية وتحسين المحاصيل حيث تزرع حبوب اللقاح بعد استعادة حيويتها على بيئات خاصة للحصول على نباتات تحتوي نصف العدد الكروموسومى. ان حبوب اللقاح لعدد من الانواع تظل محتفظة بحيوتها لفترة طويلة بعد حفظها تحت درجات حرارة منخفضة من 80 الى 196 درجة مئوية تحت الصفر.

ويتوافر حاليا جهاز (cryopreservation) (الشكل التالي) في بنوك الجينات الحديثة للحصول على درجات الحرارة المتدنية سواء كانت بطريقة التجميد البطيء والتدريجي والسريع بدقة متناهية.

شكل يوضح جهاز cryopreservation بتصريح من بنك الجينات مركز البحوث الزراعية مصر

كثيرا ما ذكر عن اهمية تقنيات زراعة الانسجة النباتية في المحافظة على النباتات المهددة  (Mala and Bylinsky 2004)  من ناحية اخري، فان نباتات الغابات بها عديد من الاشجار التي يتم استخلاص المواد الطبيعية والصيدلانية منها يحدث لها ازالة لهذه الغابات. تعتبر النباتات مصدرا هاما للدواء منذ الاف السنين وحتى اليوم. وقد قدرت منظمة الصحة الدولية (WHO) ان 80٪ من سكان العالم لا يزال يعتمد على المصادر التقليدية للعلاج هذا بالإضافة الى ان ربع وصفات الادوية عبارة عن مستخلصات نباتية. ولذلك فان النباتات الطبيعية تقع تحت ضغط شديد عالميا. ولكن يجب ان نواجه حقيقة ان قائمة النباتات والمصادر الوراثية النباتية المندثرة تزداد تدريجيا.

ومن المرجح ان تحمل طريقة الحفظ المعملي  in vitro conservationفي المستقبل الدور الرئيس في عديد من الدول وهذا قد يحتاج الى مزيد من الاهتمام لاسترجاع ما قد يضيع من التنوع الوراثي وخاصة عند توفر العديد من التقنيات المتطورة والبروتوكولات الحديثة للحفظ.

ان بعض التطورات في مجال التكنولوجيا الحيوية قد ساهمت في تغيير وتحسين الطرق المتبعة لجمع الموارد الوراثية وادارة نشاطها واستخدامها، فلقد امكن الجمع حاليا بين تقانات تكنولوجية مختلفة (زراعة الانسجة والوراثة البيولوجية والبيولوجيا الجزيئية) وذلك لاستخدامها في حفظ الموارد الوراثية النباتية. كما ان هناك طرقا اخرى واعدة مثل استخدام البذور الصناعية في حفظ النباتات ذات التكاثر الخضري.

وبعض بنوك الجينات استعملت طريقة انقاذ الاجنة وذلك للحفاظ على العينات ذات القيمة العالية. ومن المعتقد ان حفظ الحامض النووي DNA للنباتات سوف يسهم بدور فعال في الحفاظ على التنوع الوراثي العالمي.

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.