اختبار PCR

تتلخص طريقة الكشف في التركيز على اجزاء اساسية من الحمض النووي للفيروس وهي تمثل قطعا من DNA كما يمكن استخدام cDNA في حالة الفيروسات المحتوية على RNA ثم مضاعفة هذه القطع خلال استخدام بادي متخصص Primers وتوضع في جهاز PCR، ويتم مضاعفة هذه القطع الصغيرة ملايين المرات حيث يسهل الكشف عنها في النباتات حين اختبارها. وتعتبر هذه الطريقة في استخدام جهاز PCR حاليا من الطرق البسيطة وغير المكلفة نسبيا حيث يمكن استخدامها بطريقة روتينية في الوقت الحاضر للكشف عن الامراض وتعريف البكتيريا والفيروسات وغير ذلك من الكائنات الممرضة للنبات.

استخدمت طريقة RT-PCR بنجاح للكشف عن فيروسات النبات وخاصةRNA viruses  وايضا العديد من الفيروسات منها فيروس التفاف اوراق البطاطس  PLRV وتجعد اوراق العنب GFV ومرض الترستيزا Tristeza في الموالح , (Nolasco et al 2002) ويمكن ايضا باستخدام هذه الطريقة والاستعانة بجهاز Real time PCR التحديد الكمي لجزيئات الفيروس اي تركيز الفيروس في العينة المختبرة، انظر الشكل التالي. (Jarosva and Kündn 2009).

ذكر الباحثان Gibbs and Mockenzie عام ۱۹۹۷ ان طريقة PCR متخصصة جدا وهي تقنية حساسة كما انها حساسة اكثر من مائة مرة بالمقارنة بالطرق السيرولوجية ومنها ELISA بل ايضا الاف المرات عن حساسية طرق الميكروسكوب الالكتروني واضافا ان هذه الطريقة تحتاج للفحص الى اجزاء صغيرة من النبات والتي تعطي كمية كافية من الحمض النووي اللازم لاختبار ال PCR.

وتعتبر طريقة ال ELISA بالرغم من انها اقل تكلفة الا انها تعتمد في التعريف للكائن المرضي على وجود غطاء بروتيني للكائن، بينما تعتمد طريقة PCR على قطع صغيرة محددة من الحمض النووي يتم مضاعفتها في الجهاز ليسهل الكشف عن الكائن حتي لو كان تركيز هذا الكائن في النبات صغيرا جدا وكما ان ELISA قد تعطي نتائج غير مؤكدة في بعض الاحيان ( 2003. Singh et al ) وخاصة عند استخدام Polyclonal antibodies ومن ناحية اخرى يمكن الكشف عن ال  Viroidsوهو شبيه بالفيروس ولا يكون غلافا بروتينيا اعتمادا على الحمض النووي المكون له باستخدام طريقة PCR Condresse et al., 1998)).

بالرغم من ان طرق PCR يمكن استخدامها في تحديد كمية الفيروس في النبات او حتى تحديد سلالات الفيروس والتفرقة بين هذه السلالات الا ان المطلوب لخدمة مزارع الانسجة هو تحديد وبطريقة دقيقة وحاسمة وبسرعة ملائمة خلو النباتات الناتجة عن زراعة الانسجة من الكائنات الممرضة لأنه سوف يترتب على هذه الطريقة اكثار ملايين النباتات خلال الاكثار الدقيق وهذا قد يؤدي الى نشر الاصابة الفيروسية بدلا من انتاج نباتات خالية من الفيروس او المسببات المرضية الاخرى.

شكل يبين جهاز Real time PCR يستخدم في الكشف عن الفيروس وايضا للكشف عن الاختلافات الوراثية في النباتات الناتجة عن الاكثار الدقيق للتحقق من مطابقة النباتات للأصل

لقد اسهمت البيولوجيا الجزيئية بنصيب وافر في تقدم التقانات الحيوية وعلى راسها زراعة الانسجة النباتية ومن المنتظر ان يكون هناك مزيد من التطبيقات العملية في مجال الكشف الدقيق والسريع عن المسببات المرضية التي تصيب النباتات المختلفة.

المصدر

أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.