تحليل PCR (polymerase chain reaction)

المقدمة

تحفظ المعلومات الوراثية وإنتاج المواد لصنع الخلايا والحفاظ عليها في داخل الحمض النووي DNA وتقوم الخلية بمضاعفة كمية الحمض النووي وقت انقسام الخلية بشكل تلقائي وبشكل سريع مع وجود نظام تصحيح للاخطاء خلال النسخ . وتلبغ سرعة النسخ والمضاعفة الى 1000 قاعدة نيتروجينية بالثانية (داخل النظام الحيوي) وهي كما ذكرنا تحدث في الخلية في وقت التكاثر والانقسام فقط .

ومع التطور في مجال التكنولوجيا الحيوية والذي يقوم على التعامل مع الحمض النووي DNA) بشكل أساسي ، استدعى ذلك العلماء على ان يبحثوا عن طريقة او تقنية تقوم على مضاعفة كمية الحمض النووي DNA) بشكل كبير ، فكان هناك عدة محاولات لتنشيط الخلية على الانقسام المستمر بإضافة عوامل النمو growth factors ، ولكن هذه الطريقة لم تكن ذات جدوى لدى العلماء لاسباب كثيرة . الى ان توصل العالم د . كري مولس Dr . Kerry Mullis في عام 1985 (وقد حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993) بنشر اختراعه لتقنية البي سي آر PCR فكانت هذه التقنية بوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التكنولوجيا الحيوية ، من اهم الأسباب التي ساعدت هذه التقنية على الانتشار عدم اعتمادها على النظام الحيوي (أي الخلية) والتحكم بكمية الحمض النووي (DNA) وسرعة في الإنتاج ولكن كان من عيوب هذه التقنية عدم وجود نظام اصلاح أخطاء الارتباط الخاطئ miss match .

ما هو PCR :

هو تقنية مخبرية تم اكتشافها عام 1983م تقريبا تقوم على اكثار نسخ الحمض النووي (DNA) خارج النظام الحيوي . أي انها طريقة لنسخ الحمض النووي في المختبر . ولذلك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة محددة من الحمض النووي ومضاعفة انتاجها لكي يتسنى اجراء عليه اختبارات وفحوصات إضافية .

تفاعل البوليمراز السلسي PCR (polymerase chain reaction)

تهدف تقنية PCR الى تضخيم ، بعد استخلاصه من خلايا او سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه يمكن اجراء التحليل عليه .تعرف هذه التقنية بالتفاعل السلسلي لانزيم بلمرة الحامض النووي DNA وتعتمد فكرة هذا التفاعل على إمكانية تضخيم Amplification واكثار جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA وعمل ملايين النسخ منها دون الحاجة لعزلة ويمكن اجراء التحليل على هذه النسخ ، حيث يمكن لهذا التفاعل ان ينتج 100 مليار جزيء من الـ DNA من جزيء واحد فقط في لحظة البدء وخلال 6 ساعات فقط .

متطلبات تقنية PCR

• الحامض النووي المزدوج Double Stranded المحتوي على الجزء المطلوب نسخه .
• بادئ محضر صناعيا معروف نظام تعاقبه Oligannucleotid primer ويتكون من 20 نبوكليوتيدة .
• انزيم بلمرة خاص مقاوم للحرارة ، ونجح الباحثون في الحصول على هذا الانزيم وعزله من البكتريا المحبة للحرارة العالية المعروفة باسم Thermus aquatic .

خطوات تنقية الـ PCR :

1- يتم فصل الحلزون المزدوج لشريطي الحامض النووي الى خيط مفرد عن طريق عملية الدنترة (المسخ) Denaturation بتسخينه الى درجة حرارة من 94 – 95مْ .

2- يضاف البادئ المعروف تسلسله النووي الى الحامض النووي المفرد وتتم بعد ذلك عملية تبريد وتقوية nealing يخفض درجة الحرارة الى 37مْ – 65مْ اعتمادا على مدى التطابق بين البادئ المستخدم والحامض النووي .

3- يتم استطالة Extension للحامض النووي عند درجة 70 – 75مْ باستخدام الانزيم المقاوم للحرارة .

يتم تكرار الثلاث خطوات من التسخين وتقوية واستطالة للحامض النووي باستخدام نفس الانزيم السابق حتى يتم الحصول في النهاية على Unit length double stranded DNA .

وحاليا يستخدم جهاز ذاتي يعمل بمضاعفة جزئيات حامض DNA ويعرف باسم Automated Thermal Cycler وهو يستخدم الآن على نطاق واسع في معامل الأبحاث . وفي هذا الجهاز ترتفع درجة الحرارة آليا لاتمام عملية فك الشريط الحلزوني ثم تنخفض آليا لاتمام بناء الشريط موضح ادناه .

تطبيقات PCR :

لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA) والوراثة ومنها :

1) الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجبن الخاص بها ومنه نقوم بمعرفة المرض اذا كان على زوجين الكروموسومات او على احدهما (allele) .

2) تعين البصمة الوراثية .

3) الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الادق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته حيث يستخدم في الكشف عن فيروس التهاب الكبد الوبائي .

4) هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني (Recombinant DNA) الحمض النووي : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على اللازمد او الحمض النووي (DNA) المضيف .

5) استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع انزيمات القطع estriction enzyme .

6) هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA) الحمض النووي .(DNA Sequencer ) .

7) معرفة طول الحمض النووي (DNA) .

8) تقنية الحمض النووي (DNA) المكمل

9) تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات .

10) يستخدم في تقنية (microarrays) .

11) في مشروع الخارطة الجينية البشرية .(human genome project) .

12) الساوثرين بلوت (southern plot) .

13) تقنية ارتباط الحمض النووي – (DNA) وبروتين الحمض النووي (DNA ) -Protein Interaction) .

14) في مجال الطب الشرعي (اختبار الامومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية . . الخ) .