مراحل التكاثر الخضري الدقيق

تشمل عملية الإكثار الدقيق بالنسج المراحل الآتية:

- الزراعة الأولية

- الإكثار والاستطالة

- تجذير العينات

- التقسية أي نقل النباتات المجذرة من الأنابيب إلى الظروف الطبيعية.

1- الزراعة الأولية:

يشمل طور الزراعة الأولية الحصول على عينات نباتية خالية من التلوث ولها قدرة على النمو والإكثار.

تعد من أول شروط نجاح زراعة الأنسجة النباتية الحصول على زراعة عينات سليمة خالية من التلوث، ويجب المحافظة على سلامة الأنسجة النباتية من التلوث في كافة مراحل التكاثر الخضري الدقيق، لأن ظهور التلوث في أية مرحلة يؤدي إلى فشل الزراعة وموت الأجزاء النباتية المزروعة.

يعد التلوث العدو الأول في تقانات زرع الأنسجة النباتية لأنه يسبب فشل الزراعة منذ الأسبوع الأول لو قارنا الفترة الزمنية اللازمة لانقسام البكتريا (30-60 دقيقة) مع الفترة الزمنية اللازمة لانقسام الخلية النباتية (24-48 ساعة). فهذا يعني تكون مستعمرة بكتيرية مقابل انقسام الخلايا النباتية مرة أو مرتين، وطبعا المنافسة على الغذاء في الوسط المغذي تكون لصالح البكتريا، وبالتالي يلاحظ بعد أسبوع موت العينات النباتية.

تعد مشكلة التلوث مشكلة كبيرة في الإكثار الخضري، وهي مرتبطة بعدة عوامل مثل طبيعة الأجزاء النباتية ودرجة تخشبها وحجمها، بالإضافة إلى شروط زراعة النبات الأم، نوع المادة المعقمة ودرجة التركيز والفترة الزمنية المستخدمة، شروط جو التعقيم والأدوات المستخدمة، بالإضافة إلى النظافة العامة في المخبر.

ففي النخيل مثلاً تتعلق نسبة التلوث بزراعة النسج بمدى تلوث الخارجي للفسائل المستخدمة، ومدى دخول الغبار والتراب إلى داخل قلب الفسيلة. وقد استخدمت مادة هيبوكلوريت الصوديوم المضاف لها عدة قطرات من توين 80 لمدة 15 دقيقة بتراكيز مختلفة 1% (Tisserat 1984)، (AboelNil, 1986 ) %5 ، 3% ALGamdi, 1993)) و (ALMaarri and ALGhamdi, 1994) %2.

تعد مشكلة التلوث السطحي مشكلة أساسية يجب تخطيها لنجاح زراعة النسج وذلك من خلال دراسة المعقم المناسب والتركيز والفترة الزمنية المناسبة للتعقيم لكل نوع نباتي على حدى.

تعد الأوساط المغذية بيئة مناسبة لنمو الأحياء الدقيقة، لذلك يتوجب استمرار مراقبة طريقة التحضير والتعقيم حتى تكون خالية من التلوث، كما يتم التأكد من أجهزة تعقيم البيئات المغذية، لأن أي عطل مفاجئ في الأوتوغلاف يسبب ظهور نسبة تلوث 100% في العينات في كافة مراحل التكاثر الخضري الدقيق. ويمكن أن يسبب هذا كارثة حقيقية في مخبر إنتاجي، ويقضي على كافة العينات النباتية.

كما يتوجب التأكد من تعقيم أدوات الزرع والأطباق البتري والزجاجيات، ومن كفاية تعقيم الماء المقطر المعقم الذي يستخدم في غسل العينات النباتية بعد تعقيمها بالمواد الكيميائية. كما لابد من مراقبة العاملين والفنيين الذين يقومون بعمليات الزرع والنقل للتأكد من صحة تنفيذ العمليات ومن أخذ الاحتياطات الضرورية أثناء العمل من تعقيم الأيدي وتعقيم أدوات الزرع، والنقل تحت جهاز العزل الجرثومي بالشكل الصحيح.

كما لابد من التأكد أخيرا من أن جو العمل سليم وانه لا يوجد أعطال في أجهزة العزل الجرثومي.

لوحظ في بعض الأنواع النباتية وجود تلوث داخلي بكتيري لا يظهر في الزراعة الأولية، إنما يظهر في وقت لاحق في طور الإكثار وقد لوحظ في عدة أنواع خشبية مثل النخيل ( 1983 ,Tisserat, 1984; Beauchesne ) ، وفي الجوز والدفنباخيا والمشمش.

ويمكن أن يحدث التلوث داخل غرف النمو مما يؤدي إلى انتشار بعض الأحياء الدقيقة بشكل مفاجئ. وقد تسبب بعض الكوارث كما حدث في أحد المخابر المغربية لإنتاج النخيل حيث ظهر تلوث مباشرة وأدى للقضاء على 80% من الأنابيب الموجودة في المخبر (Awaain M.,1993).

تظهر نتيجة التلوث في العينات النباتية المزروعة خلال الأسبوع الأول، وتستبعد كافة العينات الملوثة ويتم المحافظة على العينات السليمة الخالية من التلوث.

1-1- العوامل المؤثرة في نمو العينات أثناء طور الزراعة الأولية:

تتعلق قدرة العينات النباتية المزروعة في الأنابيب على النمو بمجموعة كبيرة من العوامل يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات كالآتي:

- عوامل متعلقة بالنبات الأم وبالأجزاء النباتية المزروعة: مثل نوع النباتي، نوع الأصناف، عمر النبات الأم، الحالة الصحية للنبات الأم، موعد زرع العينات النباتية، شروط زراعة الأمهات، طبيعة الأجزاء النباتية المزروعة، حجم الجزء النباتي المزروع مكان الجزء النباتي على الطرود.

- عوامل مرتبطة بالأوساط المغذية المستخدمة مثل تركيب المعدني للوسط المغذي تركيز السكروز، والأحماض الأمينية، والفيتامينات طبيعة الوسط المغذي، نوع الهرمونات المستخدمة وطبيعتها وتركيزها والتوازن الهرموني في الوسط. نسبة الآجار المستخدمة ونوعها.

- عوامل مرتبطة بالشروط الجوية في غرف النمو: مثل الحرارة، الإضاءة، شدتها، فترتها ونوعيتها، والرطوبة أيضاً.

1 - تأثير عمر النبات الأم:

يؤثر عمر النبات الأم بشكل مباشر في استجابة العينات المزروعة للنمو. كلما زاد عمر النبات الأم قلت استجابتها للنمو، والإكثار بزراعة النسج. ويلاحظ هذا في النباتات الخشبية بشكل عام وفي الأشجار الحراجية وأشجار الفاكهة بشكل خاص.

فقد دلت التجارب في التفاح بان القمم النامية المأخوذة من أشجار معمرة تحتاج إلى فترة زمنية حتى تستجيب للنمو بشكل أطول (45-60 يوم) من الفترة الزمنية (30 يوم) التي تحتاجها القمم النامية المأخوذة من غراس فتية بعمر سنة ( 1977 ,.Jones et al ). ويوضح الجدول (1) تأثير عمر النبات الأم في استجابة العينات النباتية المزروعة.

جدول (1): تأثير عمر النبات الام في استجابة العينات للنمو بالنسج

يختلف طول طور الفترة بحسب الانواع النباتية، ففي بعض الانواع يستمر عدة سنوات 5-7 سنوات في اشجار الفاكهة، وفي بعض الانواع الحراجية يستمر 20-40 سنة. والفاصل بين طور الفترة وطور النضج بدء تكوين الازهار والثمار على الاشجار. ونظرا لاهمية عمر النبات الام في التكاثر الخضري الدقيق فسوف يتم التعرف على انواع العمر النباتي وعلى كيفية تجديد فترة الاشجار.

يمكن تمييز ثلاثة أنواع من عمر الأشجار الخشبية:

- العمر الزمني Chronological ageing: هو العمر الزمني الحقيقي للشجرة الذي يستدل عليه من الإنبات وحتى السنة المراد زرع العينات النباتية. شجرة بعمر 40 سنة أو 200 سنة.

- العمر التطوري Ontogenetical ageing: هي المراحل التي تمر بها الأشجار من حيث التطور من الإنبات حتى الشيخوخة، أي طور الفتي طور النمو الخضري، طور النمو والإثمار، طور الإثمار المليء، طور الشيخوخة. تختلف طول الفترة الزمنية لكل مرحلة باختلاف الأنواع النباتية.

- العمر الفيزيولوجي Physiological ageing: هي درجة النشاط الفيزيولوجي التي يتمتع بها النبات بحسب العمر التطوري والعمر الزمني، ففي طور الفتي يلاحظ نشاط فيزيولوجي كبير في النبات ومناطق النمو، أما في طور الشيخوخة يلاحظ ضعف فيزيولوجي واضح في الأشجار الهرمة. ولابد من الإشارة بأن العمر الفيزيولوجي للنموات القريبة من الجذور يكون أقل من العمر الفيزيولوجي للبراعم الموجودة في النموات الطرفية من الأشجار. وبالتالي درجة استجابتها عند زراعتها بالنسج تكون أعلى من استجابة العينات المأخوذة من المناطق العلوية من الشجرة (1990 ,.Ballester et al).

في كثير من الأحيان تحمل الأشجار المعمرة الكبيرة بعض الصفات المهمة والتي يهمنا المحافظة عليها وإكثارها، مثل المقاومة لبعض الأمراض والحشرات أو ذات مواصفات ثمرية جيدة او متحملة لبعض العوامل البيئية مثل مقاومة درجات الحرارة المنخفضة أو متحملة للكلس والجفاف لذلك يتم العمل على إكثارها بالنسج.

يتطلب تجديد فتوة الأشجار المعمرة حتى تستعيد قدرتها في النمو والإكثار بالنسج. توجد عدة طرائق لإعادة فتوة الأشجار الهرمة مثل القطع التجديدي، التطعيم على غراس بذرية فتية، التطعيم المتكرر والتعقيل المتكرر. كما لوحظ عند زرع العينات النباتية بالنسج تكتسب صفات النباتات الفتية، لذلك تعد زراعة الميرستيم أو التطعيم الدقيق أو الإكثار المتكرر من طرائق تجديد فتوة الأشجار الهرمة بزراعة النسج.

2- موعد زرع العينات النباتية:

تختلف الفترة الزمنية المناسبة لزرع العينات النباتية باختلاف الأنواع النباتية. فقد لوحظ بالتفاحيات واللوزيات بأنه أفضل موعد لزرع القمم النامية في نهاية الشتاء بعد كسر طور السكون وقبل تفتح البراعم أي في بداية آذار وحتى نهايته (2007 ,.ALMaarri et al ). وفي بعض النباتات كالورد لوحظ في بداية الربيع عندما يصل طول النموات على 10-20 سم.

أما في النخيل فقد لوحظ بان أفضل موعد لزرع العينات النباتية المأخوذة من الفسائل وذلك خلال شهر كانون الأول وكانون الثاني حيث تم الحصول على أفضل نسبة من العينات النامية وأقل نسبة اسمرار للأنسجة النباتية بالمقارنة مع أشهر الصيف التي ينعدم فيها النمو (1998 Beauchsene, 1988; ALMaarri and ALGhamdi )، وترتفع نسبة الاسمرار بسبب زيادة إفراز المركبات الفينولية وزيادة نشاط انزيمات البيروكسيديز في الصيف وتقل نسبتها في الشتاء ( 1988 ,.Bakir et al ).

3- طبيعة الجزء النباتي المزروع:

تختلف استجابة الأجزاء المزروعة بحسب الأنواع النباتية. وهناك أهمية لطبيعة العينات النباتية في درجة استجابتها للنمو، ففي بعض الأنواع النباتية لوحظت استجابة البراعم الطرفية أفضل من البراعم الجانبية. والعقل الغضة أفضل من العقل المتخشبة. وفي بعض الأنواع تلاحظ استجابة البراعم الزهرية أكثر من الأجزاء النباتية الأخرى، كما هو الحال في الجربيرا.

توجد علاقة مباشرة بقدرة العينات المزروعة للنمو مع قدرتها على التشكل وتكوين نباتات كاملة، فمثلاً في البيجونيا ريكس تبين بان زرع الأوراق أو أعناق الأوراق أعطت نتيجة إيجابية أكثر من زرع أجزاء نباتية أخرى ( 1995,ALMarri et al ). ففي نبات العرق السوس أوضحت التجارب أن زرع العقل الجانبية أعطت معدل إكثار أعلى من العقل الطرفية والقمم النامية (2016 .Badekan et al). وقد لوحظ في بعض النباتات بأن رقم العقلة على الطرود تؤثر في استجابة العينات الجانبية للتكاثر الخضري الدقيق ففي شجرة الجوافة تم الحصول على أعلى معدل إكثار من العقل الجانبية رقم 2 أكثر من العقل الطرفية والقاعدية من الطرود (2008 ,Shekafandeh and Khash-Khui).

دلت التجارب في إكثار النخيل بالنسج أنه تم الحصول على استجابة متفاوتة، وكانت القمم النامية أفضل الأجزاء المزروعة، ثم البراعم الجانبية، وأخيراً الوريقات الداخلية حول القمة النامية. أما الأجزاء النباتية المتمايزة، أو في طريقها إلى التمايز ليس لها القدرة على النمو وتكوين براعم، خضرية، بل على العكس تنمو ويزداد قطرها واستطالتها ولا تعطي أية استجابة للنمو بل يظهر عليها علامات الاسمرار وتنتهي بالموت. لذلك لطبيعة الأجزاء المزروعة في النخيل أهمية كبيرة في نجاح إكثار النخيل بالنسج (ALMaarri, 1995 ;1980,Beauchesne).

1-2- تأثير العوامل المتعلقة بالأوساط المغذية:

1- تأثير التركيب المعدني للوسط المغذي:

يختلف تأثير التركيب المعدني في الوسط المغذي في استجابة العينات المزروعة بالنسج بحسب الأنواع النباتية، فقد دلت التجارب في كثير من النباتات الخشبية ونباتات الزينة بأن أفضل محلول استخدم هو المحلول المعدني لموراشيج وسكوغ (1962)، حيث يعطي نتائج جيدة في كثير من الأنواع النباتية المكاثرة بالنسج. يمتاز المحلول المعدني MS بكونه غني بال المعدنية ويحوي كافة العناصر اللازمة لنمو العينات النباتية المزروعة، ولا يحبذ استخدام الوسط المعدني MS في بعض الأنواع النباتية لأنه يسبب ظهور مرض الشفافية، بسبب غناه بعنصر الأمونيوم، منذ طور الزراعة الأولية، كما هو الحال في بالقمم المرستيمية. ففي هذه الحالة يتم تخفيف نترات الأمونيوم إلى الربع أو النصف، للحد من ظاهرة الشفافية.

ففي تجربة نفذت على إكثار الفستق الحلبي بزراعة النسج زرعت عقل جانبية صغيرة بطول 1-2 سم غضة في عدة أوساط مغذية تحوي محاليل معدنية مختلفة وهي MS KNOP, WPM, A Anderson. وقد أضيف تركيب الوسط المغذي نفسه وبعد شهر من الزراعة لوحظ أن أفضل محلول معدني هو MS حيث أعطى أعلى نسبة نمو في العينات المزروعة والتي بلغت 66.6%، أما نسبة النمو في المحاليل الأخرى كانت بالترتيب 38% لمحلولKNOP ، 11% لمحلول WPM ، و 5.6% في محلول المعدني لـ Anderson (Abousalim,1991).

2 - تأثير الهرمونات في الوسط المغذي:

تلعب الهرمونات النباتية دوراً أساسياً في استجابة العينات النباتية للنمو. تختلف أنواع الهرمونات وتركيزها وتوازنها باختلاف الأنواع النباتية ومدى قدرة العينات التشكل والنمو، يضاف عادة ثلاثة أنواع من الهرمونات النباتية في وسط الزراعة الأولية سيتوكينيتن وأوكسين وجبرلين. وعادة تكون نسبة السيتوكينين على الأوكسين أكبر أو تساوي الواحد بالنسبة للتكاثر الخضري الدقيق لكثير من الأنواع النباتية تختلف نوعية السيتوكينينات ونوعية الأوكسينات المستخدمة وتراكيزها بحسب الأنواع النباتية. ويوضح الجدول (2) تركيز الهرمونات وتوازنها في إكثار بعض الأنواع النباتية.

جدول (2): تركيز الهرمونات المستخدمة في الزراعة الأولية في بعض الأنواع.

تتطلب بعض الأنواع النباتية إضافة الهرمونات بشكل خاص، وهي أنواع خاصة من الهرمونات النباتية كما هو الحال في النخيل حيث ثبت بأن إضافة ال 2iP أعطى نتائج أفضل من استخدام أنواع أخرى من السيتوكينينات (1995 ,ALMarri) ولابد من الذكر بأنه في بعض الأنواع النباتية يضاف الجبريلين إلى وسط الزراعة الأولية، وفي بعض الأنواع الأخرى ليس من الضروري إضافة الجبريلين.

1-3- عوامل متعلقة بشروط غرف النمو:

تؤثر العوامل الجوية في غرف النمو في مخابر زرع الأنسجة النباتية في نمو العينات المزروعة في طور الزراعة الأولية، تختلف الحرارة المناسبة بحسب الأنواع النباتية، يستخدم درجة حرارة 22 إلى 24 ± 1م بشكل عام في كثير من الأنواع النباتية. ويوجد بعض الأنواع التي تفضل التناوب الحراري بين الليل والنهار 24 ° نهارا و 12 ° ليلا.

كما تؤثر الإضاءة في نمو العينات المزروعة. يستخدم عادة 16 ساعة إضاءة و8 ساعات ظلام في غرف النمو وهذا يناسب كثير من النباتات المكاثرة بالنسج. يستعمل في بعض المعاملات شروط إضاءة خاصة كفترة ظلام في بداية زرع العينات النباتية كما هو الحال عندما يراد تكوين براعم مباشرة على أوراق أو أعناق Direct Organogenesis ، كما هو الحال عند تكوين براعم في أوراق الإجاص السوري البري، يتم وضع العينات المزروعة بالظلام لمدة 30 يوما على درجة حرارة 24م ثم تنقل على شروط إضاءة 16 ساعة يوميا بشدة 3000 لوكس ( 2009,ALMaarri & Thouma ).

تؤثر الرطوبة الجوية النسبية في نمو بعض الأنواع النباتية مثل الورد الذي لوحظ بشكل كبير انخفاض معدل إكثاره بالشتاء بسبب تدفئة غرف النمو التي عملت على خفض الرطوبة الجوية. وقد تم السيطرة على مشكلة نمو العينات المزروعة وإكثارها عن طريق زيادة الرطوبة الجوية في غرف النمو على 70% (1991 ,Coudret).

2- طور الإكثار والاستطالة:

تنمو الأجزاء النباتية أثناء طور الزراعة الأولية، وتعطي نمو بطول 1-2 سم. تنقل النموات إلى وسط خاص بالإكثار بهدف زيادة عدد النموات الخضرية المتكونة نتيجة نمو البراعم الجانبية، وتكوين براعم عرضية ونموها ونمو البراعم الطرفية.

يهدف طور الإكثار إلى الحصول على أكبر معدل من النموات الخضرية ذو النوعية الجيدة. لا يهم فقط تكوين نموات خضرية جديدة بأعداد كبيرة، بل يجب الانتباه إلى جودة النموات المتكونة ونوعيتها.

ترتبط نوعية النموات الجديدة المتكونة بثلاثة عوامل:

- أن تكون خالية من الإصابة بمرض الشفافية.

- أن تكون مستقيمة غير ملتوية وجيدة النمو.

- ان تكون ذات استطالة جيدة، وتحتوي على اوراق جيدة التكوين كما هو موضح بالشكل (1).

لابد من التذكير بأن النموات المصابة بظاهرة الشفافية تصبح ضعيفة النمو وتفقد بشكل تدريجي قدرتها في النمو والتجذير فيما بعد، وإذا جذرت تموت أثناء عملية التقسية.

2-1- نماذج إكثار النباتات بزراعة النسج:

تختلف طرائق إكثار النباتات بزراعة النسج بحسب النوع النباتي، وحسب طبيعة وطريقة نموه وقدرته على التجديد والتشكل فالنباتات الخشبية تعطي نموات تختلف بشكل جذري عن طريقة إكثار النباتات العشبية أو الريزومية، أو البصلية كما تختلف طريقة إكثار نباتات وحيدة الفلقة عن نباتات ثنائية الفلقة. لذلك يمكن ملاحظة الكثير من نماذج الاكثار بزراعة النسج ومنها:

1- الاكثار العمودي بساق واحدة: كما هو الحال بالبطاطا، اذ تنمو العينات بشكل عمودي وتصل الى طول اكثر من 10-15 سم. وفي هذه الحالة يتم تقسيم النبات الى عقل صغيرة جانبية بطول 1-1.5 سم بهدف الاكثار حيث تعود وتنمو وتعطي نمو شاقولي طويل بعد ثلاثة اسابيع. وهذا يعني انه يمكن الحصول على 7-10 عقل من عقلة واحدة خلال 3-4 اسابيع. بمعدل اكثار عال، ينصح في هذا النموذج استخدام انابيب طويلة بطول 20 سم.

شكل (1): اكثار الاجاص بزراعة القمة النامية. 1- زراعة قمة نامية، 2- نمو القمة بعد شهرين من الزراعة، 3- طور الاكثار، 4- طور التجذير.

2- الإكثار بالنموات الجانبية القاعدية: تنشأ النموات الخضرية من البراعم الجانبية والبراعم العرضية التي تتكون في قاعدة الجزء النباتي. يتم في هذه الحالة إزالة البراعم القمية للنموات مع الأوراق القديمة لتشجيع نمو البراعم الجانبية والبراعم العرضية وتكوين نموات جديدة واستطالتها، يلاحظ هذا النموذج في كثير من الأشجار الخشبية مثل التفاحيات واللوزيات الشكل (1).

3- الإكثار بالبروتوكروم: يلاحظ هذا النموذج في إكثار نباتات الأوركيد مثل السمبيديوم Cymbidium. ينشأ البروتوكروم من زراعة القمم النامية في الأوركيد وعند تطور القمة تعطي كتلاً كروية الشكل تدعى بالبروتوكروم. والبروتوكروم كتلة كروية خضراء اللون بأحجام مختلفة من 2-5 مم عندما تتطور تنمو وتعطي نمواً خضرياً، وبعد نموها يمكن أن تنقل على محلول تجذير لتجذر وتعطي نباتات كاملة أثناء الإكثار تتشكل بروتوكرومات ثانوية صغيرة الحجم وثم تتطور لتعطي بروتوكرومات جديدة وهكذا تكون وسيلة الإكثار في الأوركيد ( 1982,Hartmann & Kester, 1983; Margara ).

4- الإكثار بالبراعم الريزومية: طريقة من طرائق إكثار النباتات الريزومية بالنسج حيث يلاحظ تكون براعم على الريزوم أثناء طور الإكثار كما هو الحال في نبات الايستروميريا Estrogeria. يلاحظ في الأجزاء المكاثرة تكون جزء متضخم وعليه تتكون البراعم الريزومية وتنمو لتعطي نموات خضرية جديدة (الشكل 2) (ALMoussa et al., 2009).

5- الإكثار بالبصيلات: يلاحظ هذا النموذج في إكثار النباتات البصيلية بالنسج إذ تتكون بصيلات صغيرة في آباط الوريقات أو تتكون بصيلات جديدة ثانوية بجانب البصيلات المتكونة بالنسج يمكن أن تفصل وتنقل من جديد لمحلول إكثار لتكوين بصيلات جديدة. يلاحظ هذا النموذج في نبات الليليوم.

6- الإكثار بالأجنة الخضرية: هي إحدى النماذج الأساسية في إكثار بعض الأنواع النباتية مثل النخيل، وقد تتكون الأجنة الخضرية مباشرة دون تكوين الكالوس الجنيني أو تتكون بعد تكوين الكالوس الجنيني ( 1983,Tisserat) . تشبه الأجنة الخضرية المتكونة الأجنة الجنسية حيث عند تطور وانبات الجنين الخضري يعطي الجذير في بادئ الأمر ثم البريعم ويتطور فيما بعد ليعطي نبات كامل الشكل (4).

7- الإكثار بتشكيل البراعم مباشرة على أجزاء خضرية: يتم في هذه الحالة تشكيل البراعم مباشرة على أجزاء خضرية أو زهرية مثل البيجونيا، الجربيرا، البنفسج الإفريقي، والأرتيميزيا آنا (2009,Marri and Xie). وثم يتم إكثار هذه البراعم لتشكيل نموات وبراعم جديدة بالتقسيم. ويوضح الشكل (3) تكون النموات الجانبية من البراعم العرضية في النخيل.

ومن الجدير بالذكر بأنه يمكن ملاحظة نماذج أخرى في إكثار الأنواع النباتية لم تذكر في هذه العجالة. أو يمكن أن تشبه أحد نماذج الإكثار المذكورة مع وجود بعض الخلافات تتعلق بالنوع المدروس.

2-3- العوامل المؤثرة في إكثار الأجزاء النباتية:

هناك عوامل كثيرة تؤثر في إكثار النباتات بزراعة النسج.

- منها ما هو متعلق بالنبات الأم إذ تؤثر كافة العوامل بطور الزراعة الأولية في طور الإكثار مثل عمر النبات الأم، الحالة الفيزيولوجية للنبات الأم، موعد زرع العينات النباتية طبيعة الجزء النباتي المزروع، النوع النباتي والأصناف، كل هذه العوامل يجب أن تدرس بعناية لوضع الشروط المناسبة للحصول على معدل إكثار جيد.

فمثلا على سبيل الذكر، يؤثر عمر النبات الأم في معدل الإكثار بشكل مباشر، فالنباتات المعمرة تتصف بمعدل إكثار منخفض بالمقارنة مع النباتات الفتية وفي كثير من الأحيان لا تبدي استجابة للإكثار والنمو والأمثلة كثيرة على ذلك في مجال الأشجار الخشبية والحراجية ( 1980 ,Franklet ).

وقد لوحظ أن موعد زرع العينات النباتية يؤثر تأثيراً مباشراً في معدل نموها وإكثارها. فإذا زرعت في الوقت المناسب تنمو وتعطي معدل إكثار جيد، أما إذا زرعت في وقت غير مناسب فيلاحظ تدني معدل الإكثار بشكل كبير، ويظهر هذا الأثر بشكل واضح بالنباتات المعمرة أكثر من نباتات العشبية.

وقد لوحظ بأن الحالة الصحية للنبات الأم وشروط زراعته تؤثر في معدل الإكثار، فإذا أخذت العينات من نباتات جيدة موضوعة في بيت محمي تعطي معدل إكثار أفضل من المعدل الممكن الحصول عليه من عينات من نفس النوع مأخوذة من نباتات ضعيفة النمو أو مزروعة في ظروف غير مناسبة.

- عوامل مرتبطة بالأوساط المغذية:

تؤثر مجموعة من العوامل المتعلقة بالأوساط المغذية في معدل الإكثار بزراعة النسج في كثير من الأنواع النباتية، مثل التركيب المعدني، تركيز الهرمونات النباتية ونوعها، تركيز السكروز، طبيعة الوسط فيما إذا كان سائلاً أو صلباً ...

يختلف تركيب الوسط المناسب بحسب الأنواع النباتية، حتى بحسب الأصناف ضمن النوع الواحد.

1- تأثير التركيب المعدني في الإكثار بزراعة النسج:

يؤثر التركيب المعدني للوسط المغذي في معدل الإكثار، وفي متوسط استطالة النموات وفي نوعية النموات الجديدة المتكونة. فعند إكثار الأشجار المثمرة لوحظ بأن المحلول المعدني لموراشيج وسكوغ يزيد في نسبة النموات المصابة بمرض الشفافية (;1987 ,.Letouze and Dauguin, 1983ALMaarri et al) ويعزى السبب بان المحلول المعدني MS غني بنترات الأمونيوم ولذلك عند تخفيض نترات الأمونيوم في الوسط إلى النصف أو الربع تقل بشكل كبير نسبة العينات المصابة بمرض الشفافية ( Quoirin et Lepoivre, 1977 ).

وقد لوحظ بوضوح تأثير التركيب المعدني الخضرية المتكونة. ففي تجربة نفذت لدراسة تأثير المحلول المعدني في إكثار الإجاص والنخيل. وقد توضح تأثير التركيب المعدني في نوعية النموات المتكونة بشكل واضح كما هو موضح بالجدول (3).

جدول (3) تأثير التركيب المعدني في نوعية النموات المتكونة أثناء طور الإكثار

يختلف التركيب المعدني بين الأوساط المذكورة بمدى غناها بنترات الأمونيوم حيث MS يحوي 4 مرات زيادة عن المحاليل الأخرى وهذا ما يفسر زيادة نسبة الشفافية عند استخدامه في الوسط المغذي (ALMaarri & ALGhamdi1996).

2- تأثير تركيز الهرمونات النباتية المستخدمة في الإكثار بالنسج:

يختلف محتوى وسط الإكثار من الهرمونات النباتية بحسب الأنواع النباتية. يتوجب أن يكون مستوى السيتوكينين على الأوكسين أكبر من الواحد في كثير من الأنواع النباتية كون السيتوكينين يحد من السيادة القمية ويشجع نمو البراعم الجانبية والعرضية وتكوينها، يخالف هذه القاعدة بعض النباتات التي تتمتع بنموذج إكثار عمودي ذات النمو الواحد مثل البطاطا.

يختلف نوع السيتوكينين المستخدم وتركيزه بحسب الأنواع النباتية، وبحسب الأصناف، فبعض الأنواع تفضل الـ BAP مثل التفاحيات واللوزيات، وبعض الأنواع تفضل الكينتين مثل بعض نباتات الزينة وبعض الأنواع تفضل ايزوبتنيل آدنين مثل النخيل.

وقد دلت التجارب بأنه يزداد معدل الإكثار، وتقل نسبة استطالة النموات المتكونة مع ازدياد تركيز السيتوكينين في الوسط. كما دلت التجارب بزيادة نسبة النموات المصابة بالشفافية مع زيادة نسبة السيتوكينين في الوسط المغذي كما هو موضح بالجدول (4) عند إكثار الإجاص والسفرجل ( ALMaarri & ALGhamdi1996 ).

جدول (4): تأثير السيتوكينين في إكثار السفرجل والإجاص

مما لا شك فيه بأن زيادة تركيز السيتوكينين في وسط الإكثار يزيد في نسبة النموات الخضرية المتكونة ولكنه يؤثر بشكل سلبي على نوعيتها إذ تقل استطالة النموات وتزيد نسبة العينات المصابة بالشفافية.

وهذا مهم للحكم على التركيز الأنسب أي الذي يعطي أفضل معدل من النموات الخضرية ذو النوعية الجيدة هو 0.5 مع/ل للإجاص و 1 مغ/ل للسفرجل.

وقد لوحظت ظاهرة الشفافية أيضا عند إكثار النخيل بالأجنة، وذلك عند استخدام تراكيز عالية من السيتوكينين ( 1989,aid ، المعري 1995).

كما لابد من الإشارة إلى وجود تأثير واضح لنسبة السكروز في الوسط المغذي في معدل الإكثار وفي استطالة النموات المتكونة. إذ لوحظ أفضل تركيز يختلف باختلاف الأنواع النباتية بين 20-30 غ /ل. فالتراكيز الخفيفة تزيد من احتمال إصابة النموات المتكونة بظاهرة الشفافية كما يكون معدل الإكثار منخفضاً. أما التراكيز العالية 50 غ / ل وما فوق وتعطي نموات خالية من الشفافية، ولكن نسبة استطالتها تكون منخفضة نسبياً. وهذا الأثر غير واضح في بعض الأنواع النباتية، وقد وجد بوضوح في التفاح والأجاص.

تتكون داخل الأنابيب أثناء طور الإكثار أوراق ذات شكل مورفولوجي وفيزيولوجي خاص يختلف عن الأوراق التي تتكون بالطبيعة، فقد تبين بأن أوراق النباتات داخل الأنابيب تحتوي على طبقة شمعية رقيقة، وعلى عدد من المسامات التي تبقى مفتوحة بشكل أقل بكثير من الأوراق التي تنمو طبيعيا، كما لوحظ بأن أوراق النباتات النسيجية ذات محتوى منخفض من الكلوروفيل والنظام الأنزيمي الخاص بالاصطناع الضوئي غير مكتمل مما ينعكس سلباً على عملية الاصطناع الضوئي التي تكون شبه معدومة في الأنابيب كما هو الحال في إكثار الكيوي ( 2014 ,.Gago et al ).

كما لوحظ أن تركيز السكروز وشدة الإضاءة يؤثران تأثيراً واضحاً في محتوى الأوراق من اليخضور في الكيوي المكاثر بالنسج، وكان أفضل تركيز من السكروز قد أعطى أعلى نسبة من اليخضور وهي 2.3 % تلعب طبيعة الوسط المغذي دوراً مهماً في إكثار العينات النباتية فقد لوحظت زيادة معدل الإكثار عند استخدام المحاليل السائلة في بعض الأنواع النباتية مثل في الفريز (2005,Hanhineva et al)، وكان الأثر سلبياً في أنواع أخرى، إذ أدت إلى زيادة ظاهرة الشفافية كما في العنب.

2-4- تأثير شروط غرف النمو:

تؤثر الشروط الجوية في غرف النمو في إكثار العينات النباتية بالنسج. فعند انخفاض درجة الحرارة عن درجة الحرارة المثالية وهي بين 22 إلى 24 م تنعكس بشكل سلبي في معدل إكثار العينات النباتية وفي استطالة النموات الجديدة المتكونة.

تستخدم عادة فترة ضوئية 16 ساعة إضاءة و 8 ساعات ظلام في معظم الأنواع النباتية المكاثرة بالنسج. تستخدم أحيانا نظام إضاءة مغاير في بعض الأنواع النباتية ولأغراض خاصة محددة. كما هو الحال في البطاطا يستخدم شروط نهار قصير ( 16 ساعة ظلام و 8 ساعات إضاءة ) لتحريضها على تكوين درينات داخل الأنابيب.

تؤثر شدة الإضاءة في معدل إكثار العديد من الأنواع النباتية إذ تتطلب إضاءة ذات شدة ضعيفة إلى متوسطة، وزيادة شدة الإضاءة تحد من استطالة النموات المتكونة وتزيد من درجة تخشبها.

تؤثر الفترة الضوئية في نمو الخزعات النباتية المزروعة داخل الأنابيب، ففي ظروف النهار الطويل تكون نسبة النمو، ومحتوى اليخضور وعدد المسامات أعلى من ظروف النهار القصير (2008,Jo et al). كما تبين أن شدة الإضاءة ونوعية الإضاءة توثر في نمو العينات النباتية المزروعة بالزجاج وإكثارها. فقد لوحظ بأن الليد الأبيض أعطى نتائج إيجابية أفضل من الإضاءة بالفلورسنت الأبيض ( 2013,.Li et al ). كما هو الحال في إكثار نبات الأوركيد Vanilla planifolia في المكسيك كان معدل الإكثار عالي، عند استخدام الليد الأبيض والليد الحمر مع الأزرق (2016,Bello-Bello et al).

تؤثر الرطوبة الجوية في معدل إكثار بعض الأنواع النباتية، لأن انخفاض نسبة الرطوبة في غرف النمو تسرع من جفاف الأوساط المغذية والعينات النباتية وتقلل من إكثارها كما هو الحال في الورد.

3- تجذير العينات داخل الأنابيب:

يهدف طور التجذير إلى تكوين جذور ذات نوعية جيدة في النموات المتكونة أثناء طور الإكثار. تتكون مجموعة من النموات الخضرية التي يختلف عددها بحسب الأنواع النباتية، وليس كل النموات المتكونة صالحة للنقل إلى وسط تجذير.

يجب أن تكون النموات الصالحة للتجذير ذات نمو جيد طويلة ومستقيمة وغير مصابة بظاهرة الشفافية، وتحوي أوراقاً جيدة التكوين ودرجة تخشب الساق جيدة وغير رفيعة. لهذا السبب يجب التأكيد على نوعية النموات الجديدة المتكونة أثناء طور الإكثار حيث تشكل العينات الأساسية الصالحة للنقل إلى وسط التجذير بهدف الحصول على نباتات جيدة بعد تجذيرها داخل الأنابيب.

تختلف قدرة العينات النباتية على التجذير بحسب الأنواع النباتية، وحسب الأصناف والسلالات المختلفة ويجب التركيز في نسبة التجذير الممكن الحصول عليها وفي نوعية الجذور المتكونة كما هو موضح في الشكل (3).

ترتبط نوعية الجذور المتكونة بعدة عوامل:

1- كمية الكالوس المتكونة في قواعد العقل فكلما كانت نسبة الكالوس كبيرة تشكلت جذور ذات نوعية سيئة، لأن وجود الكالوس يؤدي إلى ضعف ارتباط الجذور مع العقلة نفسها، وبالتالي تصبح الجذور سهلة الانفصال عن النبات مما يؤدي إلى انخفاض في نسبة نجاح عملية التقسية، وقد لوحظت هذه المشكلة بشكل واضح في الإجاص (ALMarri et al., 1994).

2- عدد الجذور المتكونة.

3- سماكة الجذور المتكونة.

4- استطالة الجذور المتكونة.

تتصف الجذور بكونها ذو نوعية جيدة عندما تكون خالية أو تحوي الحد الأدنى من الكالوس وتحوي عدد جيد من الجذور الرفيعة والطويلة.

للحكم على قدرة النباتات على التجذير فلابد من الحصول على نسبة تجذير عالية نسبيا 70-80 % مع جذور ذي نوعية جيدة حتى نحصل على نباتات كاملة صالحة للنقل إلى الظروف الطبيعية.

3-1- العوامل المؤثرة في تجذير العينات النباتية داخل الأنابيب:

ترتبط قدرة العينات النباتية على التجذير داخل الأنابيب بمجموعة كبيرة من العوامل. عوامل متعلقة بالنبات الأم والعينات نفسها عوامل تتعلق بتركيب الأوساط المغذية، وعوامل متعلقة بشروط غرف النمو.

- العوامل المتعلقة بالنبات الأم:

إن كافة العوامل التي أثرت بطور الزراعة الأولية فهي تؤثر بدورها في قدرة العينات النباتية في التجذير، من هذه العوامل النوع النباتي واختلاف الأصناف، عمر النبات الأم، موعد زرع العينات النباتية الحالة الصحية للنبات الأم.

1- النوع النباتي: تختلف قدرة الأنواع النباتية في تجذير والإكثار بحسب الأنواع. يوجد أنواع سهلة التجذير مثل البطاطا، التبغ، ونباتات متوسطة إلى صعبة التجذير بالنسج مثل الأشجار الفاكهة والخشبية، ونباتات صعبة جدا وهي تحتاج إلى معاملات كثيرة حتى تنمو وتتكاثر بالنسج مثل بعض الأشجار الحراجية وبعض أصناف النخيل.

يجب القيام بدراسة تفصيلية لكافة العوامل التي تؤثر في الإكثار والتجذير عندما يراد إكثار نوع نباتي بالنسج للتوصل إلى أفضل الشروط التي يمكن أن تعطي نتائج جيدة قابلة للتطبيق.

2- عمر النبات الأم: تتصف العينات المأخوذة من نباتات فتية بقدرة كبيرة على الإكثار والتجذير، أما العينات المأخوذة من أمهات معمرة فتكون قدرتها على الاستجابة للنمو متدنية، ونسبة تجذيرها منخفضة. لذلك يتم عادة تجديد فتوة الأشجار المعمرة وحيويتها لتستعيد قدرتها على النمو والإكثار بالنسج.

يعد معيار تجذير العينات النباتية بالأنابيب أحد المعايير الأساسية في اكتساب العينات النباتية المعمرة بعض صفات النباتات الفتية، وتزداد قدرتها على التجذير Rejuvenation يعد زرع القمم المرستيمية أحد تقانات تجديد فتوة الأشجار المعمرة. ففي تجربة نفذت على أشجار هرمة من السيكويا Sequoia sempervirence بعمر 600 سنة. في حال الشاهد الفتي كانت نسبة التجذير عالية جداً ووصلت لأكثر من 90%. في حين كانت نسبة التجذير معدومة في الأشجار المعمرة نفذت عملية النقل المتكرر للقمم المرستيمية بمعدل مرة كل شهر لمدة 24 شهراً، وقد تم نقل جزء من العينات إلى وسط تجذير. وقد لوحظ أن نسبة تجذير العينات المعمرة كانت معدومة حتى عملية النقل الـ14، بعدها بدأت تزداد نسبة التجذير بشكل تدريجي حتى وصلت إلى 70% في عملية النقل 24. وهذا يعني أن عملية الزرع المتكررة للقمم المرستيمية أدت إلى ازدياد تدريجي في نسبة نموها وتجذيرها مع الزمن مما يدل على اكتسابها لبعض الصفات النباتات الفتية مع الزمن ( Fouret et al., 1987 ).

- تأثير عوامل المتعلقة بتركيب وسط المغذي الخاص بالتجذير:

يلعب تركيب الوسط المغذي دوراً مهماً في تجذير العينات النباتية في الأنابيب. ويختلف تركيب الأوساط المغذية الخاصة بالتجذير بحسب الأنواع النباتية. وهناك عوامل تدخل في تركيب الأوساط المغذية يكون لها أثر إيجابي في بعض الأنواع وقد لا تبدي الأثر نفسه على أنواع أخرى. ومن هذه العوامل التركيب المعدني، الهرمونات النباتية، السكروز وتركيزه، طبيعة الوسط المغذي، بالإضافة بعض المركبات مثل الفلوروغليسينول والفحم المنشط.

1- تأثير التركيب المعدني: يلعب التركيب المعدني دوراً مهماً في تجذير العينات النباتية بالنسج، ويختلف نوع المحلول المعدني المستخدم في تجذير الأنواع النباتية.

يستخدم المحلول المعدني لموراشيج وسكوغ بكثرة في أوساط التجذير، ولكن لوحظ بأن هذا المحلول غني بالعناصر المغذية، لذلك لوحظ أن تخفيف MS إلى النصف أو ثلاث مرات يزيد بشكل واضح في تجذير العينات في بعض الأنواع النباتية كالإجاص والتفاح والنخيل والورد. ففي الإجاص كانت نسبة التجذير باستخدام المحلول المعدني MS بشكل كامل لا تزيد عن 50% بينما عند تمديد نفس المحلول المعدني ثلاث مرات، زادت نسبة التجذير بشكل كبير إلى أكثر من 80 %. وهذا يدل أن وسط التجذير يتطلب تخفيف تركيز العناصر المعدنية في الوسط ( 1994 ,.ALMaarri et al ).

2- تأثير الهرمونات النباتية: تلعب الهرمونات النباتية دورا مهما في توجيه نمو العينات النباتية المزروعة بالنسج. يتوجب أن يكون الميزان الهرموني في وسط التجذير لصالح الأوكسين، أي أوكسين / سيتوكينين يجب أن يكون أكبر من واحد. ويفضل عدم إضافة أي سيتوكينين إلى وسط التجذير لان السيتوكينينات تثبط تكوين الجذور.

يختلف نوع الأوكسين المستخدم بحسب الأنواع النباتية. ففي بعض الأنواع الNAA يعطي أفضل نتيجة كما هو الحال في الإجاص والسفرجل، وفي بعض الأنواع IBA يعطي أفضل نسبة تجذير كما في التفاح، وفي بعض الأنواع الأوكسين IAA يعطي أفضل نسبة تجذير كما في العنب.

يلعب التركيز المستخدم دوراً مهماً في نسبة التجذير وفي نوعية الجذور المتكونة. ويختلف التركيز الأنسب باختلاف الأنواع النباتية. ففي تجربة على الإجاص فقد تم دراسة تراكيز مختلفة من الأوكسين NAA (0.5-0.2-0 - و 1مغ/ل) وقد لوحظ التأثير الإيجابي للأوكسين في تنشيط تكوين الجذور، كلما زاد تركيز الأوكسين في الوسط المغذي زادت نسبة التجذير كما هو موضح بالجدول ( 5 ).

جدول ( 5 ) تأثير الأوكسين في تجذير الإجاص وفي نوعية الجذور المتكونة

الشكل (5) تأثير تركيز الأوكسين في تجذير الإجاص

يتبين لنا من الجدول أن زيادة تركيز الأوكسين في الوسط، تزيد في نسبة التجذير وفي نسبة الكالوس المتكونة وفي عدد الجذور المتكونة، كما تعمل على تثبيط استطالة الجذور المتكونة (1994,ALMaarri et al).

تبين لنا أن نسبة الكالوس المتكونة في قواعد العقل تزداد مع زيادة تركيز الأوكسين في الوسط وهذه النقطة سلبية لان تواجد الكالوس بكميات كبيرة يؤدي إلى ضعف ارتباط الجذور المتكونة بالعقل نفسها وبالتالي يمكن أن تفقد العقل جزءاً من جذورها أثناء عملية التقسية مما ينعكس سلباً في نسبة نجاح التقسية. وهناك عامل سلبي لسماكة الجذور أيضاً، كونه يحوي في أنسجة الجذر خلايا من الكالوس مع الجذر، فإذا نظرنا للنتائج التي تم الحصول عليها بالجدول (5) تبين أن أفضل تركيز هو 0.2 مع/ل لأنه يعطي نسبة تجذير جيد ونوعية الجذور المتكونة تكون جيدة. كما هو موضح بالشكل (5).

تتمثل هنا نوعية الجذور الجيدة بالعينات التي تحوي الحد الأدنى من الكالوس مع عدد جيد من الجذور الرفيعة جيدة الاستطالة.

3- تأثير تركيز السكروز يختلف تأثير السكروز الأنسب في الوسط في تجذير العينات النباتية بحسب الأنواع. يستخدم عادة 30 غ /ل من السكروز في كثير من الأنواع النباتية. وقد دلت بعض التجارب زيادة نسبة تجذير بزيادة تركيز السكروز بين 50-70غ/ل، وخاصة في الأنواع الخشبية مثل الورد (1982 ,Aramis)، السيكويا ( 1977 Boulay)، النخيل ( 2001,ALMaarri& ALGhamdi).

يمكن تفسير دور الإيجابي للسكروز في الوسط المغذي في زيادة نسبة C/N في أنسجة العينات النباتية مما يزيد من فرص تكوين الجذور بالأنابيب.

4 - تأثير إضافة الفلوروغليسينول: لوحظ أن إضافة بعض المواد الفينولية مثل الفلوروغليسينول Phloroglucinol أو الفلوردزين Fluoridzin ، تنشط تكوين الجذور في بعض الأنواع النباتية صعبة التجذير مثل التفاح والخوخ، وقد لوحظ عدم وجود أي تأثير إيجابي في بعض الأنواع الأخرى مثل الإجاص.

وبعض أصول التفاح ( 1983,Hartmann & Kester ). ويبدو أن هذه المواد الفينولية تساند عمل الأوكسين في تنشيط تكوين الجذور في بعض الأنواع والأصناف، ولا يظهر هذا الأثر المنشط في أنواع وأصناف أخرى.

الشكل (6): طور الإكثار (1- بداية الإكثار، 2 و 3 بعد شهر) والتجذير (4) في الإجاص باس كراسان

- تأثير عوامل متعلقة بشروط غرف النمو:

تؤثر العوامل الجوية في غرف النمو في تجذير العينات النباتية، وخاصة عامل الإضاءة ونوعيتها. فقد لوحظ عند تعريض العينات النباتية لفترة ظلام لمدة أسبوع ثم تنقل إلى نظام إضاءة 16 ساعة و 8 ساعات ظلام تزيد في نسبة تجذير العينات النباتية في بعض الأنواع في التفاح، الإجاص والسفرجل والمشمش ( ;1983 ,Hartmann& Kester  1994 ,.ALMaarri et al). ويعود السبب بأن تعريض العينات إلى فترة ظلام تحمي من تدهور الأوكسين الداخلي بفعل الضوء مما يزيد في فرص تجذير العينات النباتية. ويوضح الشكل (7) إنتاج نباتات خالية من الأمراض الفيروسية بزراعة الميرستيم.

الشكل (7): زراعة الميرستيم للحصول على نباتات خالية من الأمراض الفيروسية

3-4- آلية تكوين الجذور بالنسج:

تتكون الجذور بشكل أساسي من طبقة الكامبيوم في قاعدة النموات الخضرية المزروعة في وسط تجذير مناسب، أو من بعض الطبقات التي تحوي خلايا التي لها قدرة على التمايز الرجعي مثل الخلايا البارانشيمية تختلف الفترة الزمنية اللازمة لتكوين ونمو الجذور باختلاف الأنواع النباتية المزروعة، ففي بعض الأنواع يمكن أن تجذر بـ 10-12 يوماً وفي بعض الأنواع تحتاج أسبوعين أو ثلاثة أسابيع وفي بعض الأنواع شهراً أو أكثر.

تتكون الجذور وفق المراحل الآتية:

1- يلاحظ في الأيام الثلاثة الأولى من نقل العينات النباتية نشاط حيوي كبير على مستوى طبقة الكامبيوم حيث تعمل خلايا الكامبيوم على اصطناع وتكوين كافة المواد الضرورية اللازمة للانقسام الخلوي.

2- تبدأ بعض خلايا في طبقة الكامبيوم بالانقسام الشديد وتكون نواة قمة مرستيمية تتطور فيما بعد لتكون قمة مرستيمية جذرية.

3- تستمر القمة المرستيمية المتكونة بالنمو وتبدأ باختراق الأنسجة الداخلية وتبدأ أيضا الخلايا المنقسمة الداخلية على التمايز وتكوين أنسجة الجذر المختلفة من أوعية ناقلة خشبية وغربالية تتصل بشكل أساسي مع الأوعية الناقلة في الساق كما هو موضح بالشكل (8).

4- تتابع القمة الجذرية نموها واختراقها لأنسجة العقلة في قاعدة حتى ترى بالعين المجردة وهنا تتابع القمة المرستيمية انقسامها واستطالتها وتكوين الأنسجة الجذرية الجديدة بشكل كامل.

4- تقسية النباتات إلى الظروف الطبيعية ونقلها:

تعد عملية التقسية من العمليات المهمة في التكاثر الخضري الدقيق، ولا يمكن أن تنجح عملية الإكثار ما لم يتم نقل النباتات المجذرة بالأنابيب إلى الظروف الطبيعية بنجاح.

تحتاج عملية التقسية توافر بيوت زجاجية وبيوت بلاستيكية مجهزة بأجهزة تحكم بالحرارة والري. كما تحتاج مراقد مدفأة ومظلات لحماية النباتات الصغيرة من أشعة الشمس المحرقة في أيام الصيف.

الشكل (8) مقطع تشريحي يوضح تكوين الجذر في نبات مكاثر بالنسج

تتطلب عملية نقل النباتات من الأنابيب إلى الظروف الطبيعية، عناية خاصة وكبيرة لكون هذه النباتات رهيفة وحساسة جداً لعوامل الجوية الخارجية، لهذا لا بد من توافر ظروف جوية متقاربة مع ظروف غرف النمو، وبخاصة في المرحلة الأولى من النقل. كما يجب تأمين وسط تربة جيد التهوية، خفيف جيد الاحتفاظ بالماء وجيد الصرف حتى يسمح بنمو الجذور وتكوين جذور جديدة. ولابد أيضا من حماية النباتات الصغيرة من الأمراض والحشرات عن طريق تعقيم وسط التربة المستعمل، بالإضافة إلى استبعاد أي مصدر لتلوث النباتات وأخذ الاحتياطات الكافية لحمايتها.

تتصف النباتات النسيجية داخل الأنابيب بكونها غير ذاتية التغذية Heterotrophic تعتمد اعتماداً كلياً في تأمين احتياجاتها الغذائية على الوسط المغذي. لذلك تكون لها فيزيولوجية خاصة فالأوراق تحوي على مسامات غير وظيفية، تبقى مفتوحة بشكل دائم. الأوراق التي تتكون داخل الأنابيب ذات محتوى منخفض من الكلوروفيل، ويوجد خلل بالنظام الأنزيمي الخاص بالاصطناع الضوئي مما يؤدي إلى ضعف أو عدم حدوث الاصطناع الضوئي داخل الأنابيب كما هو ملاحظ في أوراق نبات الكيوي المكاثر بالأنسجة (2014 Gago,.et al). يختلف الشكل المورفولوجي والفيزيولوجي لأوراق نباتات الأنابيب، عن الأوراق التي تتكون في النباتات الطبيعية كما يلاحظ وجود طبقة كيتينية أو شمعية قليلة السماكة، لذلك تكون حساسة لأي إجهاد بيئي مثل الجفاف أو حساسة للإصابة بالأمراض الفطرية والحشرية.

كما تكون الجذور المتكونة في الأنابيب غير وظيفية في كثير من الأنواع النباتية، فهي لا تستطيع القيام بعملية امتصاص الماء والأملاح المعدنية من التربة.

يتوجب عند عملية التقسية تقديم كافة الخدمات اللازمة لتغير فيزيولوجية النباتات من نباتات غير ذاتية التغذية إلى نباتات ذاتية التغذية Autotrophic. هذا يعني يجب العناية بالنباتات حتى تستطيع تكوين أوراق جديدة تحوي طبقة كيتينية أو شمعية، كما تحوي على مسامات طبيعية تفتح وتغلق بعكس المسامات الموجودة في الأوراق النسيجية التي تبقى مفتوحة، وتستطيع القيام بعمليات الفيزيولوجية المختلفة وخاصة الاصطناع الضوئي. كما تعطي فرصة لتكوين جذور جديدة قادرة على القيام بعمليات الامتصاص والنشاط الحيوي.

تتطلب عملية تحويل النباتات من نباتات غير ذاتية التغذية إلى نباتات ذاتية التغذية تعتمد على نفسها في تأمين الغذاء، تامين جو مشبع بالرطوبة في المرحلة الأولى وخاصة الأسبوع الأول مع تربة خفيفة ومعقمة، ودرجة حرارة تشبه درجة الحرارة الموجودة في غرف النمو. تخفض الحرارة والرطوبة الأرضية والجوية بشكل تدريجي مع الزمن حتى تتأقلم النباتات مع الظروف الجديدة وتصبح قادرة بالاعتماد على نفسها.

يتم إخراج النباتات من الأنابيب بحذر بوساطة ملاقط طويلة، وتغسل بالماء الفاتر الجاري بهدف تخليص النباتات من بقايا الوسط المغذي قبل زرعها بحذر وانتباه في وسط التربة الجديد مثل البرلايت أو الفرميكولايت أو التورب المعقم. إن عملية إزالة بقايا الوسط المغذي عملية مهمة، حتى لا نسمح للأحياء الدقيقة بمهاجمة النباتات المنقولة، وإصابتها بالأمراض والتعفنات.

تختلف نسبة نجاح تقسية النباتات الناتجة بزراعة النسج بحسب الأنواع النباتية، وحسب توفر الظروف المثالية لتنفيذ هذه العملية، ففي بعض الأنواع تسبب عملية تقسية النباتات مشكلة في بعض المناطق الجافة والحارة كما هو الحال في النخيل. وفي بعض الأنواع الأخرى تكون نسبة النجاح عالية أكثر من 90% كما هو الحال في الجربيرا، ويوضح الشكل (9) نبات إجاص بعد 3 أشهر من التقسية.

الشكل (9): تقسية النباتات النسيجية نبات إجاص بعد 3 أشهر من النمو.

تتأثر نسبة نجاح التقسية بعدة عوامل، منها الشروط الجوية كالحرارة والرطوبة والإضاءة والتهوية، والوسط المستعمل يجب أن يؤمن تهوية جيدة ليسمح بنمو المجموع الجذري بشكل مبكر وبسرعة. كما تؤثر بعض المعاملات أثناء طور التجذير في نسبة نجاح التقسية مثل تركيز الأوكسين المستخدم، وتركيز السكروز، وتركيز الآجار. فقد وجد بالتجربة في بعض الأنواع النباتية رفع تركيز الأوكسين يزيد من تكوين الكالوس في قاعدة العقل المجذرة وهذا ينعكس بشكل سلبي في نسبة نجاح التقسية ( 1983,Martin ). وقد وجد بالتجربة أيضا بأن زيادة السكروز والآجار في الوسط المغذي الخاص بالتجذير تحسن من نسبة نجاح تقسية النباتات المعمرة العشبية ( 1983 ,Hartmann&Kester ).

تؤثر فترة بقاء العينات في وسط التجذير في نسبة نجاح التقسية، فقد دلت التجارب في بعض الكرز، فقد لوحظ أن نقل النباتات بعد 15 يوماً كانت نسبة نجاح التقسية عالية بينما لم تتجاوز 10% عند نقل النباتات بعد فترة 45 يوماً من الزرع في وسط التجذير ( Marin and Gella,1985 ).