المعوقات الفيزيولوجية في التكاثر الخضري الدقيق

مقدمة:

لوحظ من خلال التجارب والأبحاث وجود بعض المعوقات الفيزيولوجية التي تظهر أثناء مراحل التكاثر الخضري الدقيق للنباتات. يمكن لهذه المشكلات أن تخفض من الإنتاج، وتحد من نجاح إكثار النخيل بالأنسجة، وتقلل من معدل الإكثار ومن عدد النباتات الناتجة ذات المواصفات الجيدة تعزى أسباب هذه المشكلات إلى عدة عوامل، منها ما هو متعلق بالجزء النباتي نفسه، وبالحالة الفيزيولوجية للنبات الأم، ومنها ما هو متعلق بتركيب الأوساط المغذية، ومن هذه المشكلات نذكر:

آ- إفراز مواد سامة في الوسط المغذي تؤدي إلى ظهور الاسمرار على الأجزاء النباتية المزروعة وتنتهي بتحلل الجزء النباتي المزروع وموته.

ب- ظهور مرض الشفافية على الأجزاء النباتية المزروعة أثناء مراحل مختلفة من الإكثار.

ج- تدهور الكالوس الجنيني، وفقدان قدرته على تكوين الأجنة والإكثار.

د- ظهور الكالوس بكميات كبيرة على قواعد النباتات أثناء طور التجذير، مما يقلل من نجاح عملية التقسية.

هـ- الثبات الوراثي للنباتات الناتجة بالأنسجة وظهوره في بعض الأحيان، نباتات شاذة أو مغايرة للنبات الأم.

1- ظاهرة الاسمرار Browning:

تعمل الأجزاء النباتية المزروعة على أوساط مغذية، على إفراز بعض المركبات السامة داخل الوسط مثل المركبات الفينولية التي تؤدي إلى اسمرار المحلول والجزء النباتي المزروع واسوداده وبعد فترة من الزمن يتحلل الجزء النباتي ويؤدي إلى موته.

ويعلل معظم الباحثين سبب الاسمرار الحاصل في الأجزاء النباتية المقطوعة، وبالتالي الوسط الملامس لها إلى أكسدة الفينولات المتعددة التي تصبح نتيجة قطع الأجزاء النباتية بتماس مع أنزيمات الأكسدة، وتتحول هذه المركبات الفينولية إلى كوينونات ذات السمية العالية للنبات. ويلاحظ ظهور الاسمرار في الوسط المغذي، إذ يتدرج اللون من الأصفر إلى البني الغامق والأسود. ويعتقد أن تثبيط حيوية الجزء النباتي ثم موته يعود أيضاً إلى الارتباط الحاصل بين الفينولات والبروتين، مما يؤدي إلى فقدان فعالية العديد من الأنزيمات.

أما الأنزيمات المسؤولة عن ظاهرة الاسمرار فهي البولي فينول أوكسيديز Poly phynol oxidase وأنزيم البيروكسيديز Pyroxydase هي الأنزيمات المسؤولة عن ظاهرة الاسمرار.

إن ظاهرة الاسمرار مشكلة كبيرة في النخيل وتحد من نجاح عملية الإكثار. وقد واجهت هذه المشكلة تقريباً جميع العاملين في مجال إكثار النخيل بالأنسجة. وتتعلق هذه الظاهرة بكثير من العوامل، يمكن إيجازها بالآتي:

شكل يبين ظاهرة الاسمرار في النخيل

- عوامل متعلقة بالنبات نفسه:

مثل عمر الجزء النباتي المستخدم، درجة تمايز الأنسجة المستخدمة نوعية الجزء النباتي المزروع، موعد الزراعة. فقد دلت التجارب أن القمة النامية تتعرض للاسمرار بشكل أقل من الوريقات الأولية والتي بدورها تتعرض لظاهرة الاسمرار بشكل أقل من الوريقات الخضراء المتمايزة. وقد لوحظ أن المبادئ الزهرية المزروعة أقل تعرضاً للاسمرار من القمم النامية والوريقات الأولية. وتبين أيضاً بأن لموعد الزراعة تأثير على فرز المركبات الفينولية حيث لوحظ أن الأجزاء النباتية المزروعة في تشرين الثاني أقل تعرضاً لظاهرة الاسمرار من الأجزاء المزروعة في الصيف (1995 Al Marri et Al Ghamdi).

- عوامل متعلقة بالوسط المغذي:

تركيب الوسط المغذي، تركيز الهرمونات النباتية ونوعيتها التركيب المعدني للوسط المغذي، نوعية الآجار المستخدم، التوازن الهرموني بين NO3- و NH4+ والبوتاسيوم.

فقد دلت التجارب أن ارتفاع نسبة NH4 + في الوسط المغذي يعمل على زيادة حموضة الوسط المغذي والذي يرافقه انخفاض واضح في امتصاص عنصر البوتاسيوم وهذا يؤثر بشكل مباشر في زيادة إفراز المركبات الفينولية في الوسط المغذي، ويقلل من تكوين الكالوس الجنيني.

وتجدر الإشارة إلى أن زيادة تركيز الهرمونات النباتية مثل الأوكسينات والـ BAP يزيد بشكل واضح من ظهور المركبات الفينولية (المعري، 1995).

- عوامل تتعلق بالظروف الجوية في غرف النمو:

مثل درجة الحرارة، وشدة الإضاءة. فقد دلت التجارب أن ارتفاع درجة الحرارة تزيد في ظاهرة الاسمرار، وظهور المركبات الفينولية السامة في الوسط المغذي. كما أن شدة الإضاءة تزيد من ظاهرة الاسمرار بالمقارنة مع الظلام.

- عوامل تتعلق بالتعقيم وطريقة الزراعة:

تزداد ظاهرة الاسمرار عند استخدام تراكيز عالية من المادة المعقمة، لفترة طويلة أثناء عملية التعقيم، وهذا يؤدي إلى إضعاف الأجزاء النباتية في الوقت نفسه. وتتوجب زراعة الأجزاء النباتية بعد تعقيمها مباشرة، لأن تركها لفترة قبل زراعتها يزيد في ظهور المركبات الفينولية السامة، ويتوجب عدم تجريح الأجزاء النباتية كثيراً. عند عملية النقل إلى وسط جديد Subculture لأن القطع والتجريح يزيد من ظاهرة الاسمرار يتم الحد من ظاهرة الاسمرار بمعاملة الأجزاء النباتية بمواد مضادة للأكسدة التي تحد من ظهور المركبات الفينولية أو بإضافة هذه المواد إلى الوسط المغذي.

فقد دلت التجارب أن إضافة الفحم المنشط إلى الوسط المغذي يعمل على امتصاص المركبات الفينولية المفرزة في الوسط المغذي، وبهذا الشكل يحافظ على الأجزاء النباتية سليمة من الاسمرار، ينصح عند استعمال الفحم المنشط زيادة تركيز الهرمونات النباتية المضافة إلى الوسط لأنه جزءاً كبيراً منها يمتص أيضاً من قبل الفحم المنشط.

وقد تم استخدام مواد أخرى مثل مزيج من حمض الأسكوربيك وحمض الستريك داخل نتيجة إيجابية، في حين لم يحد هذا المزيج من ظاهرة الاسمرار عند إضافته إلى الوسط من قبل. ولا ينصح بعض الباحثين باستعمال المزيج المذكور داخل الوسط المغذي لأنه يشجع نمو البكتريا ويزيد من نسبة التلوث.

كما استخدمت مواد أخرى في الحد من ظاهرة الاسمرار مثل البوليفينيل بيروليدون PV.P Polyvinyl. Pyrrolidone ، والكافيئين Caffeine وكان لها أثر إيجابي في الحد من ظاهرة الاسمرار كما دلت الأبحاث على أن عملية النقل المتكرر وعلى فترات قصيرة أثبت فاعلية في الحد من ظاهرة الاسمرار.

2- مرض الشفافية Vitrification:

تعد ظاهرة الشفافية من أكثر الأمراض الفزيولوجية خطورة التي تصيب النباتات في مرحلة الإكثار، وتؤدي إلى إضعاف النباتات، وتفقد قدرتها على الإكثار والتجذير، وإذا جذرت يتم الحصول على نباتات رهيفة، ضعيفة تكون نسبة نجاحها عند نقلها إلى الشروط الطبيعية محدود جداً. اكتشف مرض الشفافية في كثير من الأنواع النباتية التي تم إكثارها بالأنسجة مثل التفاح، السفرجل، الكمثرى، الورد الصفصاف، الكرمة، والنخيل.

تتصف النباتات المصابة بمرض الشفافية بساق رفيع شاحب اللون، شفاف، المسافة العقدية كبيرة، وتكون الأوراق متطاولة وشفافة وملتفة وقليلة اليخضور وتتصف خلايا الأوراق بقوامها الاسفنجي ذات فجوات كبيرة وتكون المسامات قليلة، وغالباً مغلقة. كما تحوي النباتات المصابة على كمية ضئيلة من الكامبيوم والأوعية الناقلة.

كما تتصف النباتات المصابة بمرض الشفافية بضعف نموها وضعف قدرتها على الإكثار والتجذير، وسريعة التلف. وقد دلت الدراسات التشريحية التي أجريت على الإجاص بأن النباتات المصابة بمرض الشفافية يكون فيها عدد طبقات الخشب أقل بكثير من النباتات السليمة أما في النخيل فقد لوحظ مرض الشفافية في الكالوس بسبب زيادة تركيز الهرمونات في الوسط المغذي. وقد تمت مشاهدة مرض الشفافية في النخيل على الكالوس وعلى الأجنة كما هو موضح بالشكل التالي، وبعض الأجزاء النباتية المزروعة إذ تصبح الأجزاء النباتية شفافة ويزيد محتواها المائي وتميل للاسمرار وتصبح الأجنة الصغيرة المصابة شفافة، وتفقد قدرتها على النمو الطبيعي وتميل للاسمرار. وفي نهاية الأمر يتوقف نموها وتسمر وتموت

(Al-Maarri et Al-Ghamdi, 1995)

شكل يبين ظاهرة الشفافية في الكالوس وفي اجنة النخيل

تعزى أسباب مرض الشفافية في النخيل إلى عدة عوامل ظهرت الإصابة بكثرة عند استخدام المحلول السائل (1995 AL-Maarri et Al-Ghamdi). وأيضاً ظهر مرض الشفافية عند استخدام تراكيز عالية من الهرمونات النباتية، كما لوحظ مرض الشفافية على أجنة النخيل عند استخدام المحلول المعدني لموراشيج وسكوغ دون إضافة الفحم. والسبب أن هذا المحلول يحوي تراكيز عالية من الأمونيوم NH4+

يوضح الجدول التالي اسباب مرض الشفافية وطرائق الوقاية منها في بعض الاشجار المثمرة.

جدول يبين اسباب مرض الشفافية وكيفية الوقاية منها في بعض الاشجار المثمرة (المعري 1995)

وقد لوحظ أن نباتات النخيل المكاثرة على وسط مغذي يحوي على الفحم المنشط لا تظهر به هذه الظاهرة، مما يدل على أن الفحم المنشط يمكن استخدامه كعلاج في التخلص من ظاهرة الشفافية وبخاصة عند استخدام تقانة الأجنة الخضرية في إكثار نخيل التمر.

وقد دلت الأبحاث الحديثة التي أجريت على النباتات المصابة بمرض الشفافية انخفاض وزنها الجاف بالمقارنة مع النباتات السليمة، كما تزداد كمية الماء بشكل كبير في النباتات المصابة، وفي الوقت نفسه يلاحظ انخفاض مقدار السللوز، وانخفاض نشاط أنزيمات البيروكسيديز، ونقص في اللغنين في النباتات المصابة بالمقارنة مع النباتات السليمة.

3- تكون الكالوس على قواعد النباتات:

يعد تكون الكالوس على قواعد العقل أثناء طور التجذير والإكثار أمرا غير مرغوب فيه، ففي حال إكثار النخيل بالبراعم، يمكن أن يؤدي ظهور الكالوس على قواعد الأجزاء النباتية إلى تطور بعض البراعم بدءاً من الكالوس، وفي هذه الحالة يمكن أن تظهر بعض النباتات المغايرة في تركيبها الوراثي عن النبات الأم. ولذلك يتوجب استبعاد جميع النباتات المشكوك بها. أما فيما يتعلق بطور التجذير، فإن تكون الكالوس على قواعد النموات أثناء مرحلة التجذير أمر غير مرغوب، لأنه يضعف درجة ارتباط الجذور مع النبات الأصلي، وبالتالي تقل فرصة نجاح عملية التقسية إذ تنفصل في هذه الحالة، ويمكن أن تتكون بعض الجذور من الكالوس ولا تكون مرتبطة بالنبات الأم مما يسهل فصلها عند عملية التقسية.

ولذلك يجب استبعاد النباتات التي تظهر عليها هذه الحالة، كما يتوجب العمل على الحد من تكون كميات كبيرة من الكالوس على قواعد النموات أثناء طور التجذير. ويمكن ذلك عن طريق تخفيف تركيز الأوكسينات المستخدمة في الوسط المغذي الخاص بالتجذير.

4- تدهور الكالوس الجنيني، وفقدان قدرته على تكوين الأجنة Callus Degradation:

يفقد الكالوس الجنيني قدرته على تكوين الأجنة الخضرية والإكثار عبر الزمن، من خلال عمليات النقل المتكرر على المحلول نفسه لفترة طويلة. وقد لوحظت هذه الظاهرة في عدة أنواع نباتية مثل التبغ، الجذر، الخس... (1982 ,Margara).

فقد أوضحت التجارب أن الكالوس يحتفظ بقدرته على الإكثار، وتكوين الأجنة الخضرية لفترة زمنية. ويلاحظ بعد عدة عمليات من النقل المتكرر على وسط مغذ محدد أن الكالوس تنخفض قدرته على تكوين الأجنة الخضرية تدريجياً حتى تصل إلى مرحلة تتوقف تماماً ويقال بأن الكالوس أصبح متدهوراً، وبعد فترة من الزمن نتيجة لعمليات النقل المتكرر.

يبدأ ظهور بعض التغيرات على مستوى التركيب التشريحي للكالوس الجنيني إذ يلاحظ تهشم الطبقة الخارجية للكالوس ويتحول من الشكل الحبيبي إلى الشكل الرخو. وتتراكم في بعض الخلايا المركبات الفينولية، ويأخذ اللون المسمر إلى البني، ويصاب بمرض الشفافية. ويفقد الكالوس قدرته على تكوين الأجنة والانقسام وينتهي بتدهور الكالوس Callus degradation وعلى مستوى الخلايا يصغر حجم السيتوبلاسما، وتزداد نسبة الماء والفجوات في الخلايا، وتصبح الخلايا شفافة وتفقد في النهاية قدرتها على الانقسام.

ولم تعرفا لأسباب الحقيقية للتدهور إلى الآن، ولكن وضعت عدة فرضيات منطقية تفسر التدهور الذي يحصل في الكالوس ومن هذه الفرضيات:

أ- يمكن أن تعزى أسباب التدهور إلى أسباب وراثية، اختلاف في عدد الكروموزومات الموجودة في الخلايا (Aneaploidy, Polyploidy). وقد لوحظت هذه التغيرات في الكروموزومات في الكالوس والتي تؤدي إلى تدهوره.

وقد دلت الأبحاث بوجود علاقة وثيقة بين تغير التركيب الوراثي وقدرة الكالوس على إعطاء نباتات كاملة في التبغ. وإن التغير في عدد الكروموزومات الموجودة في خلايا الكالوس يؤدي إلى توقف قدرة هذا الكالوس على إعطاء نباتات كاملة.

وتجدر الاشارة إلى أنه يمكن أن يحدث توقف في قدرة الكالوس على تكوين الأجنة مع الزمن دون حدوث تغير في التركيب الوراثي.

ب- يمكن أن تعزى أسباب التدهور في الكالوس إلى عوامل فيزيولوجية غذائية أو هرمونية. إذا يلاحظ بأن الكالوس يحتاج إلى بعض المركبات أو الهرمونات حتى يتابع نموه وتكوين الأجنة، وهذه المواد تستهلك مع الزمن وبالتالي يحدث التدهور (1982,Margara).

وقد لوحظ ظهور التدهور في الكالوس عند استخدام تراكيز هرمونية عالية وخاصة D 2.4. وذلك مع مرور الزمن، وعلى الرغم من الثبات الوراثي للكالوس.

كما دلت بعض التجارب أن قدرة الكالوس على تكوين الأجنة يمكن أن تتوقف عبر الزمن نتيجة استخدام وسط مغذ خالي من 2.4.D وتعزى الأسباب إلى استهلاك المحتوى الداخلي من هذا الهرمون الذي يعد عاملاً مهماً لتكوين الأجنة الخضرية.

وفي الحقيقة فإن الأمر أعقد من ذلك، وإلى الآن لم تعرف الأسباب الحقيقية لتدهور الكالوس الجنيني. وفقدان قدرته على تكوين الأجنة.

يلجأ العلماء حالياً للحفاظ على أكبر فترة ممكنة من الكالوس الجنيني، وبعيداً عن التدهور، إلى حفظ قسم منه على درجات منخفضة جداً بالتجميد -196م بالآزوت السائل، ويمكن في هذه الطريقة حفظ الكالوس الجنيني لفترة غير محدودة. وقد أثبتت هذه الطريقة جدواها.