تجهيز الأكاروسات للدراسة Preparing Acarus for Study

لقد تم تطوير العديد من التقنيات المجهرية خلال العقود الخمسة الأخيرة مما ساعد في إجراء الدراسات الخاصة بدراسة التراكيب الدقيقة للاكاروسات وأن أحد العوامل المهمة في هذا المجال هو التجهيز الجيد والواضح للعينة المدروسة. إن هذه التقنيات استخدمت في الدراسات البصرية Optical أو بالدراسات التي تتم بواسطة المجهر الإلكتروني Scanning Electron Microscope. ففي الدراسات البصرية فان الوضوح يعتمد على عمق حقل الصورة Depth of field الذي يكون على أقل ما يمكن وأن عينة الحلم يجب أن تكون منبسطة وشفافة لتعطي أكبر قدر من الوضوح بينما المجهر الإلكتروني يستبعد جميع هذه المشاكل، وعليه فان التحضيرات الخاصة بالحلم المحفوظ للدراسة المجهرية تختلف إن كانت هذه التحضيرات ستستخدم في المجاهر الاعتيادية أم المجاهر الإلكترونية.

التحضيرات المجهرية Microscopes Preparation

1- التحضيرات الخاصة بالمجاهر الاعتيادية Preparation for Ordinary Microscopes

وتمتاز السلايدات أو العينات المجهزة للمجاهر الاعتيادية بدرجة عالية من الشفافية ولتحقيق ذلك لابد من تنظيف جسم الحلم أو العينة بشكل جيد مع إزالة الأنسجة المعتمة قبل وضع الحلم على الشريحة الزجاجية. إن تحقيق شفافية العينة يمكن أن يتم من خلال ما يلي:

أ– استخدام محاليل الترويق Clearing Agents: هناك العديد من المواد الكيميائية التي يمكن استخدامها لتمزيق الأنسجة الداخلية للحلم المحفوظ من دون تكسير الهيكل الخارجي لجسم الحلم وأن أحد أكثر المواد شيوعا واستخداما في هذا المجال هو اللاكتوفينول Lactophenol والذي يحضر من المواد التالية التي تضاف بالتعاقب:

50 جزء   Lactic Acid

25 جزء Phenol Crystals

25 جزء Distilled Water

توضع العينة في محلول اللاكتوفينول عند درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع دون أن يتأثر الهيكل الخارجي للحلم. إن تسريع عملية تمزيق الأنسجة الداخلية للحلم يمكن أن يتم من خلال رفع درجة حرارة المحلول، وفي حالة الحلم الكبير بالحجم يمكن عمل ثقب أو أكثر في جسم الحلم لتسهيل عملية دخول اللاكتوفينول إلى تجويف الجسم، كما يفضل أيضا عمل مثل هذه الثقوب في حالة الحلم المليء بالدم أو الذي يحتوي جسمه على صبغات داكنة مع الضغط الخفيف على جسم الحلم لإخراج هذه المواد ويغمر بعد ذلك بمحلول اللاكتوفينول لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة الغرفة كما يمكن اتباع الطريقة نفسها مع عينات الحلم الجافة.

إن العديد من المواد الحامضية الخادشة والمروقة استخدمت في هذا المجال منها حامض اللاكتيك Lactic acid ومحلول s'Andre المتكون من:

3/1 Glacial Acetic Acid

3/1 Chloral Hydrate

3/1 Water

كذلك هناك محلول Vitzthum's ويتكون من :

10 أجزاء  Chloral Hydrate

9 أجزاء Phenol

1 جزء Distilled Water

أما محلول Nesbit's فيمتاز بقوته لذا يوصى باستخدامه مع العينات القديمة أو مع العينات المحفوظة بالكحول والتي لا يمكن ترويقها بالطرق الأخرى ويتكون هذا المحلول من:

40 غرام  Chloral Hydrate

25 مل  Distilled Water

2.5 مل  Concentrated hydrochloric acid

العديد من المحاليل أيضا جهزت لاستخدامها مع الحلم الاريوفي الذي يمتاز بصغر حجمه وشفافيته والذي يجمع في الغالب من الأجزاء النباتية الجافة. إن أحد أبسط هذه المحاليل والذي يوصى باستخدامه قبل تحميل الحلم على الشريحة هو محلول Kono”s  والذي يتكون من:

100 غم Chloral Hydrate

10 غم Glycerine

1 مل Concentrated Hydrochloric Acid

5 مل Distilled Water

وبالرغم من نجاح المحاليل السابقة الذكر في ترويق العينات إلا أنه من الضروري مراعاة عدم غمر العينات وخاصة تلك التي تمتاز بعدم تصلب الكيوتكل فيها لأكثر من المدة المقررة حيث أن ذلك قد يؤدي إلى تمزق العينة وعدم إمكانية تشريحها بالطريقة التي تؤدي إلى زيادة توضيحها. كما أن الغمر لفترة طويلة قد يؤدي إلى زيادة شفافية العينة بحيث يصبح من الصعب ملاحظتها ودراستها تحت المجهر، وللتغلب على هذه المشكلة يمكن إضافة بعض الصبغات لزيادة وضوح العينة منها مثلا صبغة اللكنين البنفسجية Lignin Pink Dye.

ب- الهضم الأنزيمي Enzymatic Digestion: استخدمت طريقة الهضم الأنزيمي للأنسجة الداخلية في الأنواع التابعة لحلم الماء من عائلة Halacaridae والأنواع الأخرى من الحلم الداكنة أو ذات الكيوتكل الغامق حيث استخدم Trypsin المذاب في التولوين Toluene أو Pepsin إذ يتم عمل ثقب في جسم الحلم قبل غمره بالمحلول الأنزيمي لتسهيل عملية دخول المحلول إلى تجويف الجسم.

ج- التشريح Dissection: تستخدم هذه الطريقة مع أنواع الحلم التي تمتاز بصلابة أجسامها وعدم نجاح محاليل الترويق في زيادة شفافيتها كالأنواع التابعة لمجاميع Gamasida و Oribatida والتي تمتاز ألواح أو صفائح الجسم الظهرية والبطنية فيها بصلابتها ولونها الغامق مما يمنع أو يحجب الرؤية الجيدة لتراكيب الحلم المختلفة، لذلك فان حل هذه المشكلة يكون عن طريق تشريح الحلم وذلك بفصل السطح الظهري عن البطني بأدوات تشريح مناسبة وكذلك إزالة الفكوك الملقطية والأجزاء المطلوب دراستها، ويفضل أيضا غمر العينات قبل تشريحها بمحلول اللاكتوفينول لمدة 48-72 ساعة وذلك لزيادة مرونة الجليد ثم غسل العينة عدة مرات بالماء ونقلها بعد ذلك إلى أثيل الكحول Ethyl Alcohol تركيز 20-40% في زجاجة ساعة لتشريحها بعد ذلك. إن عملية تشريح الحلم هي عملية دقيقة ومعقدة وتتم باستخدام أدوات تشريح دقيقة جدا وباستخدام المجهر المجسم Stereomicroscope.

2- المجهر الإلكتروني Scanning Election Microscopy

يعتمد عمل المجهر الإلكتروني على حزمة إلكترونية ذات طاقة عالية جدا وأن هذه الحزمة تنتقل أو تتحرك بشكل متعرج ZigZag فوق سطح العينة وأن هذا التيار يمر في أنبوبة ملف كاثود الأشعة ينتج صورة مكبرة على سطح الأنبوبة وأن هذه الصورة تنقل للرسام الدقيق Micrograph لأغراض الدراسة.

إن تجهيز العينات لأغراض الدراسة في المجهر الإلكتروني يتطلب أن تكون العينة جافة بشكل جيد، حيث أظهرت الدراسات أن أفضل العينات المفحوصة بالمجهر الإلكتروني كانت تلك العينات التي قتلت وهي حية طرية في هواء سائل Liquid Air أو النايتروجين المذاب في 5% هيدروكسيد البوتاسيوم أو في ماء مغلي، كذلك تم الحصول على عينات جيدة للمجهر الإلكتروني بالتجفيف البارد Freeze - Dried للعينات الطرية أو بالتجفيف بالهواء الجاف لعينات محفوظة بالكحول.

كما ينصح قبل استخدام التجفيف بالتجميد غمر العينة في محلول 5% من هيدروكسيد البوتاسيوم لمدة 4-6 ساعات ثم غسلها بالماء المقطر ونقلها إلى محلول مائي لحامض Picric وبعد تثبيت العينة يتم غسلها مرة أخرى بالماء المقطر، وتوضع على منخل قياس 400 مش (Mesh) لحين جفاف العينة من الماء، يتم وضع المنخل في النايتروجين السائل لمدة 5-10 دقائق بعد ذلك تثبت العينة على شريحة معدنية باستخدام Gum Chloral أو Epoxy Resin أو شريط لاصق قبل تغليف العينة بطبقة موصلة رقيقة من الذهب أو الذهب والبلاديوم -Gold Palladium تحت التفريغ الهوائي.

إن التقنيات المستخدمة في المجهر الإلكتروني أدت إلى إيضاح الكثير من الأسرار المتعلقة بالحلم نظرة للصور الواضحة والتكبير الجيد لهذه الكائنات الصغيرة.

تحميل أو تصبير الأكاروسات على شرائح Acarus Mounting

إن صغر حجم الأكاروسات يتطلب دراستها وملاحظتها تحت المجاهر المختلفة وهذا يتطلب بطبيعة الحال وضع عينة الحلم على شريحة زجاجية مناسبة لكي يسهل دراستها بشكل مؤقت أو دائمي. إن التقنيات والمواد المستخدمة في هذا المجال متعددة ومتباينة جدا بحسب الباحث ونوع الحلم المستخدم في الدراسة وكذلك الهدف من الدراسة. العديد من الباحثين يفضلون استخدام الشرائح المؤقتة عند دراسة الأكاروسات الكبيرة الحجم والحلم الخنفسي Oribatida وذلك باستخدام الشرائح المقعرة مع غطاء للشريحة واستخدام حامض اللاكتيك Lactic acid كوسط للتحميل. كذلك أمكن استخدام بديل للشرائح المؤقتة في دراسة الحلم الخنفسي وذلك باستخدام شريحة الكاربون Carbon - block . حيث توضع عينة الحلم على سطح قطعة الكاربون التي يتم ترطيبها بكحول 70% بواسطة أنبوبة شعرية مرتبطة بخزان للكحول حيث يتم ملاحظة أو رؤية العينة بوضوح تحت الضوء لأن الكاربون الرطب يوفر خلفية سوداء للعينة. إن وضوح تراكيب أو أجزاء العينة يتطلب أيضا معاملة العينة بمحاليل الترويق المناسبة. الباحث بالوف Balogh استخدم طريقة لترويق الحلم الخنفسي Oribatida وذلك بنقل عينات الحلم المحفوظة في كحول تركيز 75-85% إلى محلول بنسبة 1: 1 من 90% اثيل الكحول وحامض اللاكتيك في قنينة صغيرة وتركها تحت درجة حرارة الغرفة حيث يتبخر الكحول ويبقى الحلم في حامض اللاكتيك حيث يصبح شفافا خلال 3-4 أيام ويصبح ملائما لوضعه على شريحة مقعرة.

أما بالنسبة للشرائح الدائمية Permanent فان هناك العديد من بيئات التحميل المستخدمة في هذا النوع من الشرائح، وأن جميع هذه البيئات هي تحوير لبيئة Berlese's Gum Chloral Fluid. إن جميع هذه البيئات هي بيئات مائية ومن عيوبها أنها تمتص الرطوبة من الجو المحيط مما يؤدي إلى تغيير نسب محتويات البيئة، كما أن ذلك يؤدي إلى تبلور وتكسر العينة بعد فترة من تجهيز الشريحة وللتغلب على هذه المشكلة لابد من غلق غطاء الشريحة بمادة تمنع امتصاص الرطوبة من الجو المحيط. ومن أشهر بيئات التحميل المستخدمة:

1- بيئة هوير Hoyer's Medium: استخدمت هذه البيئة بشكل واسع ويتم تحضيرها من خلط المكونات التالية:

50 مل Distilled Water

30 غرام Gum Arabic

200 غم   Chloral Hydrate

20 مل Glycerine

ويتم تحضير هذه البيئة بإذابة المكونات الصلبة ومن ثم إضافة بقية المحتويات والخليط الناتج يتم ترشيحه باستخدام صوف الزجاج.

2- بيئة فاورز Faure's Medium: وتتكون هذه البيئة من:

50 مل Distilled Water

30 غرام Gum Arabic

50 غرام Chloral Hydrate

20 مل Glycerine

3- بيئة كلارك ومورشيتا Clark & Morshita Medium: وتتكون هذه البيئة من:

5 غرام Methocellulose

2 غرام Carbowax 4000

1 مل Diethylene Glycol

100 مل Lactic Acid

75 مل Distilled Water

ويتم تجهيز هذه البيئة بخلط ال Methocellulose مع الكحول ثم إضافة بقية المكونات وترشيح المزيج خلال صوف الزجاج ويتم تسخين البيئة عند درجة حرارة 40 - 45 °م لمدة 3-4 أيام. هذه البيئة تستخدم في الدول التي تمنع تداول مادة Chloral Hydrate كونها مادة مخدرة.

4- بيئة هينز أو بيئة ال Lactophenol Medium - Poly Vinyl Alcohol: وتتكون من:

10 غرام Poly Vinyl Alcohol

100 غم Chloral Hydrate

35 مل Lactic Acid

25 مل Phenol 1%

10 مل  Glycerol

60 - 40 مل Distilled Water

هذه البيئة أكثر ثبات من بقية البيئات ولا تؤدي إلى تكسر العينة.

بيئات تحميل أو تصبير الحلم الاريوفي أو رباعي الأرجل

Eriophyid Mites Mounting Media

بالرغم من إمكانية استخدام بيئات تحميل أو تصبير الحلم السابقة الذكر في تصبير الحلم رباعي الأرجل، إلا أن خصوصية هذا الحلم من حيث صغر حجمه من جهة وشفافيته من جهة أخرى يجعل من المنطقي استخدام بيئات خاصة للمساعدة في حفظ الشرائح لأطول فترة ممكنة وزيادة الوضوح من ناحية أخرى أمر مرغوبة. ومن أهم بيئات تصبير الحلم الاريوفي ما يأتي:

1- وسط كيفر Keifer Media: وتتكون من:

15 غم Sorbitol

20 مل Distilled Water

30 غم  Chloral Hydrate

0.7 غم Sodium Iodide

1.5 - 1 مل Glycerine

2 مل Cyclohexanel

ويفضل إضافة بلورات اليود ليصبح لون المحلول داكنا.

2- خليط حامض الهيدروكلوريك والسوربيتول: يضاف 5 سم3 من حامض الهيدروكلوريك وغرام واحد من السوربيتول ويستعمل هذا المحلول الخليط بمعدل قطرة واحدة لكل قطرتين من محلول مكون من:

15 غم Sorbitol

4 غم Gum Arabic

وللمحافظة على جسم الحلم من التمزق وكذلك المحافظة على سوءة الحلم أثناء تحضير النماذج يفضل عمل شق في بعض النماذج لإخراج الضغط الداخلي من الشق.