التعرف على الامراض الفيروسية والفيروسات المسببة لها

التعرف على الفيروسات المسببة للأمراض النباتية من العمليات المعقدة، وحتى إذا ما كان من المؤكد إصابة نبات ما بمرض فيروسي فانه يلزم أيضا التوصل إلى ما إذا كان المسبب فيروس واحد أو أكثر من فيروس، ولذلك فان هناك بعض الخطوات التي يجب التأكد منها حتى يتم التعرف على الفيروسات المسببة.

اولا: التعرف على الأمراض الفيروسية Detection:

إذا أصيب النبات بأي مرض وكان المسبب كائن آخر غير الفيروس فان المسبب نفسه يمكن أن يوجد في أو على أنسجة العائل المصاب ويمكن فحصه ميكروسكوبيا. إذا كان المسبب فيروس فان الجزيئات الفيروسية لا يمكن رؤيتها بالميكروسكوب الضوئي ( بالرغم من أن بعض الأجسام أو البللورات المحتوية على الفيروس قد تشاهد في الخلايا المصابة). فحص قطعات من الخلايا المصابة أو فحص العصير الخام المستخلص من نباتات مصابة بالفيروس تحت الميكروسكوب الالكتروني قد تكشف عن الجزيئات الشبيه بالفيروس وقد لا يمكن ذلك، فجزيئات الفيروس ليست دائما من السهولة أن تلاحظ تحت الميكروسكوب الالكتروني. وحتى في الحالات النادرة التي يمكن فيها إزاحة النقاب عن مثل هذه الجزيئات فان البرهان على أن هذه الجزيئات عبارة عن الفيروس وان هذا الفيروس هو المسبب للمرض يحتاج إلى تأكيدات أخرى.

قليل من أمراض النبات الفيروسية يمكن التعرف عليها بشيء من التأكيد، أي يمكن القول بأن مسببها فيروس، إلا أن هناك عديدا من الأعراض التي تسببها الفيروسات قد تتشابه مع تلك الناشئة عن الطفرات، أو نقص العناصر الغذائية او العوامل البيئية عموما، أو التوكسينات، أو إفرازات الحشرات، أو كائنات مرضية غير الفيروس أو عوامل أخرى. بناءا على ذلك فانه في عديد من أمراض النبات الفيروسية يلزم التأكد من أن المسبب عبارة عن فيروس وهذا يستلزم استبعاد أي احتمال آخر يمكن أن يسبب المرض، كذلك يستلزم نقل الفيروس من النبات المصاب إلى النبات السليم بطريقة تستبعد معها نقل أي مسبب آخر.

يمكن التأكد من المسبب المرضى إذا ما وضعنا في الاعتبار ما يلي:-

(أ) من المعتاد اعتبار ان المسبب المرضي هو فيروس إذا ما أمكن نقله بطريقة ما إلى النبات العائل وأعطى اعراضا مثل التي يعطيها الفيروس. في معظم الحالات ثبت أن ذلك صحيحا بواسطة اختبارات تأكيدية، ولكن أحيانا يكون ذلك خطأ. فعلى سبيل المثال وصف مسبب مرضي منذ مدة وأعطى اسم beet latent virus وظهر اسمه كفيروس في الأبحاث المختلفة، وقد أعتبر المسبب فيرس نتيجة للاعتماد إلى حد كبير على أن السبب يوجد بدون أعراض في البنجر ويحظى بقعا على اللوبيا وبعض النباتات الأخرى عند عدواها ميكانيكيا بالعصارة النباتية الغير مرشحة، ثم ثبت أخيرا (عام 1961) ان المسبب ليس فيروسا وإنما بكتريا Pseudomonas aptata.

(ب) ظهور الأعراض المرضية بعد التطعيم أو العدوى الميكانيكية يدل على أن المرض لا يمكن أن يكون ناشئ عن طفرة في النبات ولا يمكن ان يكون راجع إلى عوامل بيئية، ولكن لا يستبعد. احتمال اشتراك البكتريا او الفطريات أو وجود مواد سامه.

(ج) التأكد من عدم وجود أي كائن آخر ممرض فانه تستخدم بيئات صناعية، ودراسة مدى وجود كائنات ممرضة يمكن انمائها عليها، كذلك يستخدم الفحص الميكروسكوبي للنسيج المصاب وللعصارة النباتية للنبات المصاب حيث ان الكائنات المسببة للأمراض باستثناء الفيروس يمكن مشاهدتها بالميكروسكوب الضوئي.

(د) يرشح عصير النبات المصاب خلال مرشحات تحجز البكتريا فإذا بقي العصير بعد ذلك معديا فيعتبر ان هناك فيروسا موجودا وكذلك قد توجد مسببات أخرى يمكنها المرور من المرشحات.

(هـ) يفرق بين الفيروسات والتوكسينات أو أي عوامل أخرى غير حية يمكنها أن تسبب خللا فسيولوجيا عند نقلها إلى النباتات الأخرى على أساس إجراء عديد من عمليات العدوى (نقل الفيروس) المتتالية من نبات إلى آخر، وبالتالي فأي مادة سامة قد تكون موجودة في النبات الأصلي المصاب فأنها سوف تخفف بدرجة كبيرة لا يكنها معها إحداث أعراض في اختبارات العدوى المتتالية. استمرار الأعراض في الظهور على النباتات يدل على وجود الفيروس.

(و) الطرق الحديثة من تنقية Purification واستخدام الميكروسكوب الالكتروني والاختبارات السيرولوجية كلها طرق تستخدم في الكشف عن وجود الفيروس، ولكن تنقية الفيروس لا تجرى عادة ما لم يثبت بالطرق الأخرى وبشكل قاطع أن المرض ناشئ عن فيروس. تنقية الفيروسات ليست سبلة أنما يلازمها بعض الصعوبات. لذلك فان عددا قليلا نسبيا من الفيروسات المعروفة قد تم تنقيتها.

الطرق السيرولوجية تستخدم في الكشف والتعرف على الفيروسات في النباتات، وبالإضافة إلى أنها طريقة سريعة فأنها تستخدم عمليا في الكشف عن الفيروسات في النبات الام وفي الدرنات وغيرها من النباتات المستخدمة لإنتاج نباتات خالية من الفيروس، إلا أن الصعوبة الأساسية في استخدام الطرق السيرولوجية ترجع إلى أنها تستخدم فقط في الكشف عن الفيروسات التي درست جيدا وعن الفيروسات التي يمكن الحصول على الأمصال المضادة antisera الملائمة لها.

ثانيا: التعرف على الفيروس Identification:

بعد التأكد من أن المسبب المرضي هو فيروس، فان هناك بعض الاختبارات التي يلزم اجراءها للتعرف على الفيروس.

عموما فان التعرف على الفيروس يقوم على أساس دراسة المدى العوائل للفيروسات، والأعراض التي يعطيها على النباتات المختلفة، وطرق الانتقال، وخواص الفيروس في العصارة المعدية، والصفات الكيماوية والطبيعية للجزيء الفيروسي، والصفات السيرولوجية والوقاية المتبادلة.

فيما يلي بعض النقاط التي يجب وضعها في الاعتبار:-

(۱) نقل الفيروس إلى أنواع عديدة من العائل قد تكون كافية لوضع الفيروس في احدى المجموعات الكبيرة والعديدة مثل الموزايك mosaic ،أو الاصفرار yellows أو البقعة الحلقية ringspot.

(ب) دراسة المجال العوائل host range للفيروس ونوع الأمراض الناتجة قد تساعد في التفرقة بين هذا الفيروس و بين العديد من الفيروسات داخل كل مجموعة.

(ج) دراسة طريقة النقل سوف تشير إلى ما إذا كان الفيروس ينتقل ميكانيكيا وإلى أي عائل أو ينتقل بواسطة الحشرات ونوع الحشرة وهكذا، وكل صفة جديدة يمكن التوصل إليها سوف تساعد في تحديد صفات الفيروس.

(د) إذا كان الفيروس ينتقل ميكانيكيا فان هناك عديد من صفات الفيروس التي عن طريق معرفتها قد تؤدي إلى تضييق احتمالات التعرف على الفيروس، ومن هذه الصفات درجة الحرارة المميتة والتعمير in vitro ودرجة التخفيف النهائية.

(هـ) إذا ما أمكن التكهن بنوع الفيروس فقد تجرى اختبارات الوقاية المتبادلة والسيرولوجي، فاذا كانت النتيجة إيجابية فانه يمكن اجراء فحص تجربي بالميكروسكوب الالكتروني، ويدرس الداخل مع بعض الفيروسات الأخرى، كذلك تعدى به اصناف عوائل أخرى.

و- التعرف على الفيروسات التي لا تنتقل ميكانيكيا يجب أن يقوم أساسا على الأعراض والمجال العوائلي والتأكد من الحشرة الناقلة (إذا كانت معروفة) والعلاقة بين الحشرة والفيروس. إذا كان النقل يعتمد على تضاعف الفيروس داخل الحشرة فان إجراء اختبار الوقاية المتبادلة داخل الحشرة يكون مفيدا.

(ی) إذا كانت الطريقة الوحيدة المعروفة للنقل هي التطعيم فيمكن في بعض الحالات إجراء اختبار الوقاية المتبادلة.

بالنسبة للفيروسات الجديدة أو الغير شائعة فقد تجرى كل الاختبارات السابقة أو العديد منها، اما بالنسبة للفيروسات الشائعة في الطبيعة فان التعرف العملي على الفيروس قد يتم عن طريق الأعراض المثالية التي ينتجها على العائل أو على أي عائل آخر يعتبر كدليل indicator ، أو بواسطة الاختبارات السيولوجية الخاصة بالفيروس المتوقع، أو بالتعرف على الحشرة الناقلة المتخصصة، أو عن طريق الفحص بالميكروسكوب الالكتروني لمصير النبات. فمثلا إذا أعتقد أن الفيروس الغير معروف هو فيروس موزايك الدخان فأننا في هذه الحالة قد نترك بعض الخطوات بدون اجرائها وتكون الخطوة الأولى هي دراسة التفاعل بينه وبين المصل المضاد له، فاذا حصلنا على تفاعل قوي تجرى بعض التأكيدات مثل عدوي أنواع مختارة من النباتات، وتقارن الأعراض على أصناف الدخان التي يصيبها كيانيا والتي يعطي عليها بقعا محلية، وتقدر له درجة الحرارة الفاقدة لنشاطه... الخ.

ثبت حديثا وجود انواع من الفيروسات غير ثابتة والتي تخلو من الغلاف البروتيني الخاص بها وتختلف هذه الأنواع من الفيروس الأصلي في درجة الثبات - التفاعل مع العائل - الانتقال - الشكل المورفولوجي. ونظرا لأن هذه الأنواع خالية من البروتين فأنها لا تكون أجسام مضادة عند حقنها في الحيوانات، وتتبع طرق خاصة في التعرف عليها.

ثالثا: الكشف على فيروسين او اكثر مسببين للمرض النباتي وفصلهم:

عدد من الأمراض النباتية تكون نتيجة الإصابة النبات بفيروسين أو أكثر ولذلك فعند الكشف عن المرض النباتي يجب أن نفترض دائما أنه ناشئ عن بمجموعة من الفيروسات، فاذا ثبت أن ذلك صحيحا فيجب العمل على فصل كل فيروس على حده والتعرف عليه، وهناك طرق عديدة تتبع في مثل هذه الحالات، بعضها معقد وليس في متناول كل دارس، وفيما يلي بعض الخطوات والخطوط الرئيسية التي قد يمكن إتباعها أو التحوير فيها على حسب ظروف كل حالة.

1- إثبات أن مسبب المرض أكثر من فيروس:

يراعى في ذلك ما يلى:

(أ) في بعض الحالات فان الفحص الدقيق للنباتات المصابة قد يدلنا عل وجود أكثر من فيروس، فمثلا قد يوجد على النباتات المصابة عرضين مرضيين (أو أكثر) واضحين ومحدودين، كذلك فعن طريق الفحص الميكروسكوبي للنبات المصاب قد نجد نوعين (أو أكثر) مميزين للأجسام الداخلية.

(ب) إذا كان النبات المصاب منزرعا في صوبة زجاجية يجري العمل فيها بفيروسات محددة ومحدودة العدد فإنه في هذه الحالة قد يمكن إجراء اختبارات بالطرق السيرولوجية او بعدوى النباتات المشخصة لهذه الفيروسات للتأكد من وجود أكثر من فيروس.

(ج) عموما فهناك اختبارات أولية يجب إجراؤها للكشف عن وجود أكثر من فيروس في النبات وذلك عن طريق نقل العدوى من النبات الأصلي المصاب إلى أنواع عديدة للنباتات المختلفة على أن يتم العدوى بواسطة عديد من الطرق المختلفة وبتخفيفات متعددة للعصير. بعد حوالي أسبوعين أو ثلاثة يعاد عدوى انواع سليمة من النبات الأصلي، وتجرى العدوى من الأوراق التي ثم عدواها وكذلك من الأوراق التي لم تعدى على نفس النبات، فإذا كان النبات الأصلي مصابا بفيروس واحد فإنه عند إعادة العدوى سوف تظهر نفس الأعراض، أما إذا لم تظهر نفس الأعراض الأصلية فمعنى هذا وجود أ كثر من فيروس.

۲- فصل الفيروسات عن بعضها من النبات المصاب:

بعد التأكد من أن المسبب المرضى أكثر من فيروس فإنه يجب فصل كل فيروس على حده والتعرف عليه، ويراعى في عملية الفصل ما يلي:

(أ) الفصل باستخدام عوائل مختلفة:

إذا ما نقلت العدوى من النبات الأصلي إلى عدد من الأنواع النباتية (باستخدام طرق عدوى مختلفة وتخفيفات متفاوتة من العصارة فإن هناك احتمالا لما يلى:

1- أن يوجد نوع نباتي قابل للعدوى بفيروس واحد ومنيع للأخرين، وفي هذه الحالة يسهل فصل هذا الفيروس.

2- أن يوجد نبات اختبار يصاب کيانيا بفيروس واحد في حين أن باقي الفيروسات تتمركز في الأوراق (تعطى بقعا علية مثلا) وفي هذه الحالة يعزل الفيروس من الأوراق الغير معداه.

3- أن يصاب نبات اختبار ما جهازيا بجميع الفيروسات ويكون هذا العائل مفيدة إذا كانت الفيروسات تتحرك بداخله بنسب مختلفة وعلى هذا قد يمكن فصل فيروس ما من القمة النامية أو من أي جزء طرفي آخر على أوقات متفاوتة من وقت إجراء عملية العدوى.

4- أن تظهر بقع موضعية محددة ومميزة على نبات اختبار نتيجة للعدوى بعصارة مخفية وفي هذه الحالة فإن استخلاص بقعة واحدة قد ينتج عنه فصل فيروس أو أكثر من باقي الخليط.

(ب) الفصل باستخدام طرق عدوى مختلفة:

قد يتم الفصل عن طريق إتباع طرق مختلفة في نقل العدوى، فقد ينتقل واحد منها مثلا بالحامول وآخر ميكانيكيا وثالث بالحشرات.. الخ ويراعى في ذلك ما يلي:

1- إذا كان في الخليط فيروس واحد هو الذي ينتقل ميكانيكيا فانه يسهل الحصول عليه ، أما إذا كان هناك أكثر من فيروس يمكن نقلهم ميكانيكيا فإن إجراء العدوى بتخفيفات متفاوتة يمكننا من فصل فيروس واحد عن الآخرين، وخاصة إذا ما كان هناك أكثر من فيروس يمكن نقلهم ميكانيكيا ولهم نقط تخفيف نهائية متقاربة، ويكون من المفيد عدوى عديد من النباتات بتخفيفات عالية على أساس أن النقل في بعض الحالات سوف يقل عن 10% وعلى ذلك تصاب بعض النباتات بالصدفة بفيروس واحد والبعض الآخر من النباتات بصاب بفيروس آخر.

2- إذا كان النقل يتم بواسطة الحشرات فإن ذلك يفيد في الفصل فقد تنقل الحشرة فيروس واحد إلى أحد النباتات، وإذا كانت الحشرة تنقل أكثر من فيروس فإن إجراء عمليات النقل المتابعة بواسطة الحشرات إلى عوائل مختلفة قد ينتج عنه إصابة نبات ما بفيروس معين وإصابة نبات آخر بفيروس مخالف، كذلك فإن هناك اختلافات في العلاقة بين الفيروس والحشرة الناقلة، وهذه يمكن الاستفادة بها في عملية الفصل.

(ج) الفصل باستخدام معاملات تؤثر على ثبات الفيروس:

قد تختلف الفيروسات الموجودة في الخليط في درجة ثباتها وهذه يمكن استغلالها بالعمل على التخلص من فيروس أو أكثر من الخليط كما يلى:-

1- تسخين العصارة المعدية على درجات حرارة مختلفة.

۲- ترك العصارة على درجة حرارة المعمل فترات متفاوتة.

( وذلك بالإضافة إلى ما سبق من استخدام تخفيفات مختلفة للعصارة ).

(د) الفصل باستخدام طرق أخرى:

1- في أثناء خطوات العمل السابقة قد يتم التعرف على فيروس أو أكثر وفي هذه الحالة يمكن ترسيب مثل هذه الفيروسات من الخليط بواسطة المصل المضاد إن وجد.

۲- أحيانا قد يمكن استخدام بعض المواد الكيماوية على أساس أن تأثير هذه المواد يختلف من فيروس لآخر، فلا يختلف فيروس موزايك الدخان وفيروس البقعة الحلقية في الدخان tobacco ringspot virus في مدى مقاومتها اللفينول وبرمنجنات الصوديوم. الفيروس الأول يثبط باستخدام الفينول بتركيز 4% بعكس الثاني، في حين أن برمنجنات الصوديوم بتركيز 12% تثبط الثاني بعكس الأول الذي لا يتأثر بها كثيرا. كذلك فإن فيروس × البطاطس يثبط تحت الظروف الحامضية في حين أن فيروس موزايك الدخان يثبط تحت الظروف القلوية.

٣- في بعض الحالات قد تستغل ظاهرة أن عصارة بعض النباتات تحتوي على مواد مثبطة inhibitors تؤثر بدرجات متفاوتة على الفيروسات المختلفة فمثلا عصارة نبات Mentha piperita لها تأثير مثبط واضح على فيروس potato calico ( إحدى سلالات alfalfa mosaic virus ) ولكن ليس لها هذا التأثير على فيروس الشجيرة القزمية في الطماطم tomato bushy stunt virus

4- هناك عديد من الطرق الأخرى المستخدمة في فصل الفيروسات عن بعضها مثل الترشيح خلال أغشية بها ثقوب مختلفة الأقطار ومثل تلك الطرق المبنية على الخواص الكيماوية والطبيعية مثل:

Density ion exchange chromatography, continuous free – flow electrophoresis, sucrose density gradient centrifugation, zone electrophoresis

رابعا: التأكد من فصل جميع الفيروسات:

بعد فصل الفيروسات المختلفة فإنها تخلط مع بعضها ويستخدم للعصير في عدوى أصناف من العائل الأصلي فإذا أنتجت أعراض مخالفة للأعراض الأصلية فهذا قد يعني فقد فيروس أو أكثر من مخلوط الفيروسات الأصلي، وبالتالي يجب إعادة عمليات الغسيل باتباع خطوات عمل أخرى أو قد يلزم إجراء مزيد من عمليات الفصل. إذا نتجت نفس الأعراض الاصلية بعد عدوى العائل الأصلي فهذا يعني أنه قد تم فصل الفيروسات المختلفة، مع ملاحظة أنه من عمليات الفصل الجائز في أثناء العمل أن الذي فصل هو سلالة أو أكثر موجودة بنسبة ضئيلة في المخلوط الأصلي، كذلك من الجائز أن يكون هناك فيروسين من الصعب فصلهما وهناك بعض الاعتبارات الأخرى التي لا تهم إلا المتخصصين.

العديد من أمراض الاصفرار والتقزم وغيرهما تسببها mycoplasma وليس فيروس وللتعرف على الميكوبلازما والتفرقة بينها وبين الفيروس تلزم طرق خاصة كالفحص بالميكروسكوب الالكتروني للحاء النباتات ودراسة تأثير مشتقات مجموعة التتراسيكلين tetracycline إذ أن هذه المواد تؤثر على الميكوبلازما ولا تؤثر على الفيروس ، وهذا بجانب بعض الطرق الأخرى.