دور التقنية الحيوية في تربية المحاصيل لتحمل الجفاف
Role of biotechnology in breeding for drought tolerance
يزداد تعرض المساحة القابلة للزراعة لظروف الإجهاد، الأمر الذي يحد من احتمال الحصول على مستويات محصول عالية تحت هذه الظروف. ويعد تحمل الجفاف ظاهرة معقدة مسئول عنها التعبير المتزامن لعدد من الجينات التي تتفاعل مع متغيرات الطقس وظروف التربة والمراحل التطورية للمحصول. ويتطلب ذلك ضرورة تطوير التراكيب الوراثية لتحمل ظروف البيئة القاسية مع فقد قليل في المحصول.
ولقد ساهمت طرق التربية التقليدية على مدى العقود السابقة في تحسين إنتاجية عديد من المحاصيل، إلا أن هذه الطرق لها محدداتها والتي ترجع إلى محدودية المستودع الجيني، ووجود بعض الحواجز بين الأنواع والأجناس والتي تحد من نقل الجينات... وغيرها. وتقدم للبيولوجيا الجزيئية طرقاً جديدة لتعيين الجينات المسئولة عن تحمل الإجهاد البيئي غير الحيوي في الأنواع بعيدة القرابة، والكائنات الحية، ونقل الجينات المنتخبة إلى نباتات المحاصيل، قاهرة بذلك حواجز عدم التوافق والبعد الوراثي
فتعتبر الهندسة الوراثية أداة هامة في منظومة البحث العلمي لتطوير تحمل نباتات المحاصيل لظروف الإجهاد البيئي والتي ظهرت ثمارها في عديد من النواحي كما سيأتي ذكره .
أ- الواسمات الجزيئية وتعيين جينات تحمل الجفاف :
Molecular markers and identification of drought tolerant genes
تلعب الواسمات الجزيئية المرتبطة بالصفات المسئولة عن تحمل الجفاف دوراً هاماً في تحسين تحمل الجفاف في برامج التربية. وتتعدد الطرق المستخدمة في تعيين جينات التحمل والتعرف على التراكيب الوراثية المتحملة للجفاف، ومن أهم هذه الطرق ما يلي:
أ - 1 - التفريد الكهربي للبروتينات الذائبة Electrophoresis
يعتبر الفصل الكهربي للبروتينات من المعلمات الوراثية الكيموحيوية، وأداة فعالة في التعرف على وتشخيص مختلف أصناف المحاصيل وذلك من خلال الأشكال المختلفة للحزم التي يمكن رؤيتها بصبغات إنزيمية معينة على جيل النشا. وتعطى طريقة التفريد الكهربي دليلاً مباشراً على وجود الجين المؤثر في صفة ما وذلك نظراً لأن كل أنزيم يتحكم في إفرازه جين معين بشكل مباشر .
وقد استخدمت هذه التقنية بكثرة كاختبار سريع ودقيق في التنبؤ بالتفاوت الهجيني والقدرة على الائتلاف في هجن عديد من المحاصيل الحقلية. حيث أفادت على سبيل المثال، في تمييز إثنين من الحزم هماMW 122.76 , 81.96 KDa كمعلمات و Marker bands في خمسة آباء وعشرة هجن ناتجة عنها في الذرة الشامية. وأمكن تمييز ستة هجن بعدد من الحزم يفوق آبائها، أظهرت قوة هجين لمحصول الحبوب تحت ظروف الجفاف (2004 ,Abdel - Sattar and Ahmed) .
كما ساعدت في تعضيد نتائج الانتخاب المباشر للمحصول في غسل الجيل الثاني وتمييز بعض العائلات المتفوقة عن آياتها في قمح الديورم تحت الظروف البيئية المختلفة. وأظهر تحليل جودة الحبوب قيماً عالية لـ SDS ومحتوى البروتين والصبغة الصفراء في سلالات الجيل الخامس المبشرة (1998 ,Al - Hakim and Jaradat) .
علاوة على ذلك، فقد ساعد تطبيق هذه التقنية في التشخيص الجزيئي للجينات المرتبطة بالإجهاد، وتمييز الفروق الوراثية بين الأصناف المتباينة في تحملها للجفاف حيث ظهرت حزم مفرقة مميزة لصنف الأرز المتحمل N22 وغابت في الصنف الحساس Panichan ، تحت ظروف الإجهاد المائي والرش بحمض الابسيسيك، تم قطعها ومضاعفتها وادخالها إلى حوامل مناسبة، واختبار الحزم المدخلة إلى الحوامل في التراكيب الوراثية الناتجة لظروف الإجهاد (2003 ,.Tyagi et al).
إلا أن التقديرات المتحصل عليها من تحليل الايزوزيم ربما تكون متحيزة أو بها انحراف Biased نظراً لأن هذا النمط من التحليل يعتمد فقط على جزء قليل من الجينوم (1982 Second,). ولذلك اتجهت الدراسات إلى استخدام تقنيات تشخيصية أكثر تقدماً تعطى درجة أعلى من الدقة في التشخيص اعتمادا على دنا.
أ-2- معلمات د.ن.ا (دنا) DNA - markers
تحتاج صفوة سلالات التربية الناتجة في الأجيال الانعزالية عقب التهجين أو المعاملة بالمطفرات إلى التشخيص الوراثي للتعرف على التركيب الوراثي وحماية حقوق المربى Protect breeder's right . ومن المعروف أن تقدير التباين الوراثي في نباتات المحاصيل يعتمد على الصفات المظهرية، وتقدير بعض المؤشرات الوراثية ، إلا أن هذه الطرق ينقصها القدرة على التحقق Resolving power المطلوبة للتعرف على السلالات الناتجة.
وتفيد التقديرات المتحصل عليها من تحليل الايزوزيم Isozyme في عملية تشخيص التراكيب الوراثية، إلا أنها قد لا تعطى النتائج المرجوة. ولذلك استخدمت في السنوات الأخيرة طرق متقدمة في عملية التشخيص عرفت بالمعلمات الجزيئية أو معلمات دنا مثل QTL, STS, SCAR, ISSR ،SSR, AFLP PCR ، RAP ، RFLP وغيرها .
وتمكن هذه الطرق من تقدير التباين الوراثي على مستوى الحمض النووي دنا وتحديد درجة القرابة بين التراكيب الوراثية وحتى الانعزالات الفردية. ونظراً لأن تحمل الجفاف من الصفات المعقدة، لذا يعمد مربى النبات إلى دراسة الصفات المرتبطة وتعيين المواقع الوراثية المسئولة عن وراثة هذه الصفات والانتخاب لها بمساعدة هذه المعلمات الوراثية Marker assist selection بهدف تحسين تحمل الجفاف.
أ-2-1- تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل (Polymerase chain reaction (PCR :
تعتبر الـ PCR من التقنيات الهامة في تشخيص الأمراض الجينية في الإنسان، وأمراض النبات ودراسة العلاقات الجينية على مستوى الأنواع وتحت الأنواع، وتحديد المحتوى الجيني وتعريف التراكيب الوراثية التي تحمل جينات المقاومة من خلال الاختلاف في أشكال الحزم Williams et al., 1990) Pattern of bands).
وتتميز هذه التقنية بالسهولة والسرعة، حيث يحتاج تضاعف وفصل د. ن . ا من 6-4 ساعات فقط بعد عملية استخلاص دنا، كما أنها أقل احتياجا إلى التجهيزات المعملية والعمالة، وأكثر أماناً لعدم ضرورة استخدام مواد مشعة علاوة على احتياجها إلى كميات قليلة من مستخلص .د. ن . ا (الشكل التالي) . وتوجد عدة أنواع من تحليل الـ PCR منها:
AP - PCR, MR - PCR, AS - PCR, RT-PCR, ALU - PCR, : ، RAPD - PCR .
وقد أمكن توظيف تقنية الـ PCR في دراسة وغربلة 85 تركيب وراثي من عشيرة هجين الأرز IR 64 x Azucena ، حيث تحقق وجود ارتباط موجب ومعنوي بين أقصى طول للجذر ومعلمي الانتخاب 14 OPBH و 201 RM تحت ظروف الجفاف (Mane et al., 2003).
كما أفادت تقنية النسخ العكسي لتفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR) وتحليل الفصل اللوني للأنزيمات Spectrophotometer في التمييز بين أصناف القمح المختلفة على مستوى دنا حيث لوحظ حدوث تعبير عالي لنشاط جين Ascorbate peroxidase (APx) تحت ظروف الإجهاد في الأصناف المتحملة C306، PBW 175 ، PBW 396 ، 2285 HD مقارنة بالأصناف الحساسة 8027 K، HD 2781 ،NI 5439 ,HDR 77 ، وكانت الزيادة في النشاط الأنزيمى أعلى ما يمكن في الصنف المنحل Das . C306,and Bansal 2003 كما مكنت تقنية الـ PCR - CTPP من تحديد اثنين من الاليلات لجين الطبقة الشمعية في الجيل الثاني لهجين الشعير : 9456 x Yon Kei 1 931 on Ki وكانت نسبة الانعزال 1 : 2 : 1 ، في إشارة إلى وجود موقع واحد ذو اليلين يتحكم في وراثة هذه الصفة (2004 ,.Doman et al)
شكل يبين تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل ((PCR
أ - 2 - 2 - تقنية الـ RAPD Random amplified polymorphic DNA
تستخدم هذه التقنية في التعرف على الصور والأشكال المظهرية المتعددة والاختلافات الوراثية وتعريف الأصناف ودراسة علاقات نشوء وتطور الأنواع وتحديد النسب في مدى واسع من الأنواع النباتية . فقد أمكن توظيف هذه التقنية في تقدير درجة التباعد الوراثي وعلاقة القرابة بين قمح الخبز T. aestivum والقمح الأوروبي T. spelta وقمح Sun et al, 1998) Tibetan) وفى تقسيم الأصول الوراثية للقمح (Cao et al., 1999) وتعريف الأصناف وتحديد النسب وعمل بصمة دنا في سلالات وأصناف القمح (2003 ,.Cao et al., 2002 and Teshale et al) .
كما أفادت تقنية الـ RAPD في توصيف الاختلافات الوراثية بين ستة تراكيب وراثية من قمح الخبز المصري تمثل الآباء الثلاث سخا 8 وجيزة 164 وسدس 1 وثلاث منتخبات ناتجة عنها هي الطفرة الشمعية والمنتخبة من سدس 1 المشعع، والمنتخب الثاني V2 من الهجين سدس 1 x جيزة 164 والمنتخب الثالث V3 من الهجين سخا 8 × جيزة 164 . وقد أعطى 12 بادئ من بين 17 بادئ عشوائي اختلافات على مستوى الحمض النووي دنا. وأظهر المنتخب الثالث V3 المتحمل للجفاف أكبر عدد من الواسمات السالبة الفريدة (6) ، أمكن استكشافها بالبادئين 16 OPB- و 12 - OPA. وقد تميز كل من التركيب الوراثي المتحمل V2 والصنف سخا 8 بواسم سالب فريد أمكن تحديده بالبادئين 06 - OPB - 16 , OPB ، على الترتيب. وكانت أعلى نسبة تماثل وراثي (96 %) بين الأب سدس 1 والطفرة الشمعية : 1 V ؛ 91.6 % بين الأبوين سخا 8 وجيزة 164 و91 % و 86.4% بين المنتخب الثالث V3 وكل من أبويه جيزة 164 وسخا 8، على الترتيب (Al - Naggar et al., 2004 b) .
كما أفادت هذه المعلمات في تحديد المواقع الوراثية المرتبطة بتعبير تحمل الجفاف في 98 سلالة مرباة داخلياً من الذرة الرفيعة من الهجين بين الصنف 7078 TX (المتحمل للجفاف - قبل التزهير - الحساس بعد التزهير) والصنف B35 (الحساس قبل التزهير - المتحمل بعد التزهير) تحت ظروف جفاف قبل التزهير والري الكامل. حيث أمكن باستخدام 150 معلم من الـ RAPD و 20 معلم من الـ RFLP ، تعيين 6 مواقع جينومية ارتبطت مع تحمل الجفاف في مرحلة ما قبل التزهير و 8 مواقع كانت أكثر ارتباطا مع المحصول أو مكوناته تحت ظروف الري الكامل وارتبط تعبير عديد من المواقع مع تحمل الجفاف تحت ظروف الإجهاد المعتدل والشديد (.1996 Tinstra et al).
1 - 2 - 3 - تقنية الرفلبات :
Restriction fragment length polymorphism (RFLP)
يعتبر تحليل الرفلبات أداة هامة للتمييز بين عينات دنا على مستوى الأنواع والسلالات والتعرف على نشوء الأنواع وتحديد العلاقة الوراثية بين وفي داخل الأجناس وتعريف الأصناف وتقييم التراكيب الوراثية وعمل الخرائط الوراثية. كما يستخدم كأداة مساعدة للانتخاب في برامج التربية لتحسين الصفات الهامة حيث تظهر حزم فريدة في الأصناف المقاومة وتغيب في الأصناف الحساسة .
شكل يوضح كيفية استخدام تقنية الـ RFLP في الانتخاب لأحد الصفات المرتبطة بالمقاومة للجفاف في برامج التربية
ويوضح الشكل نظام حزم الـ RFLP في 6 سلالات من القمح تختلف في المقاومة للجفاف. فإذا كان معروفاً من بين السلالات الست تميز السلالة 2 و 4 و 5 بالمقاومة للجفاف، ونظراً لوجود الحزمة C في هذه السلالات المقاومة 2 و 4 و 5 فقط وغيابها في السلالات الأخرى الحساسة 1 و 3 و 6 . فتشير معلمات الـ RFLP إلى ارتباط الحزمة C بالجين المتحكم في الصفة المرتبطة بالمقاومة للجفاف.
(عن: Poehlman and Sleper, 1996)
ويعتبر العالم Botstein ومساعدوه (1980) أول من إستخدموا هذه التقنية في رسم الخرائط الكروموسومية للإنسان، ثم تلى ذلك استخدامها في الكائنات المختلفة. ويعتمد هذا النوع من المعلمات على التباين الموجود في تتابعات القواعد المكونة لدنا بين السلالات المختلفة .
وقد أمكن تطبيق هذه التقنية في برامج السميت CIMMYT لتربية الذرة الشامية، وساعدت في تحديد الجينات المتحكمة في مقاومة الإجهادات، من خلال الارتباط الحادث بين المعلمات الجزيئية وتلك الجينات.
فقد استخدمت معلمات الـ RFLP في تعيين الجينات المتحكمة في مقاومة الجفاف وساهمت في تحديد المواقع الوراثية المؤثرة في القدرة المحصولية تحت ظروف الشد الرطوبي، حيث أفاد استخدام تحليل الـ RFLP في معلمات الصفة الكمية QTLS في تبيان التأثير المعنوي للمواقع الجينومية الموجودة على الكروموسومات 1 ، 3 ، 5 ، 6، 8 في تحمل الذرة الشامية للجفاف (1996 Agrama and Mousa)، وتعيين المواقع المسئولة عن تركيز حمض الابسيسيك في أوراق الذرة الشامية تحت ظروف الجفاف (1998 ,.Tuberos et al). كما أفادت تقنية الـ RFLP في تعيين 6 مواقع جينومية لتحمل الجفاف في مرحلة ما قبل التزهير في سلالات هجين الذرة الرفيعة 35 Tuinstra et al., 1996) TX 7078 × B) وفي تعيين ثلاث مقاطع طولية محددة مستقلة متعددة المظاهر من دنا في عشيرة عباد الشمس 52 SA × 4 HAR ، مثلت حوالي 35 % التباين في الصفات المرتبطة بتحمل الجفاف (Lambrides et al., 2002).
أ-2- 4 معلمات الصفة الكمية Quantitative trait loci QTLs
لما كانت المقاومة للجفاف تبدو من الصفات الكمية المعقدة التي يحكمها عديد من العوامل الوراثية وتتأثر إلى حد كبير بالظروف البيئية ومسئول عنها العديد من الصفات النباتية ؛ الفينولوجية والمورفوفسيولوجية والكيموحيوية، كان من الأهمية دراسة المواقع الوراثية المتحكمة في وراثة تلك الصفات من خلال معلمات الصفة الكمية QTL.
فقد أفادت معلمات الصفة الكمية QTLS استنادا إلى الخريطة الكروموسومية لـ 48 سلالة ثنا أحادية من القمح باستخدام تقنیتي AFLP و SSR ، في إثبات أن الجينات المؤثرة في صفة طول فترة حياة ورقة العلم، كمحدد لتحمل الجفاف، واقعة تحت نظام التحكم الوراثي غير البسيط ومحكومة بجينات على الكروموسومات B2 و 2D .
(Verma et al., 2004)
وبتطبيق تقنية معلمات الصفة الكمية QTLS على 167 سلالة في الجيل الثامن لهجين الشعير بين الصنف Tadmor (المتحمل للجفاف) و Er/ Apm (المتأقلم لظروف بيئية معينة) ، أمكن تحديد 1 إلى 12 موقع للصفة الكمية QTLS، تشير إلى احتواء الجينوم على عديد من الجينات المتحكمة في الصفات المرتبطة بتحمل الجفاف مثل محتوى الماء النسبي للورقة الجهد الأسموزي للورقة ، والضبط الاسموزي وكفاءة استخدام الماء وتركيز المواد الكربوهيدراتية الذائبة في الماء. وقد ارتبط اثنان من الجينات الجديدة وثماني تتابعات مختلفة التعبير مع معلمات الصفة الكمية QTLS للصفات المرتبطة بتحمل الجفاف (2004 ,.Diab et al ) .
وفى الأرز، أمكن قياس تعبير نصف جيناته تقريباً (21.000 جين) واكتشاف 12 جين في الأب المنخفض الضبط الاسموزي 9993 CT عند مستويات الإجهاد الرطوبي المتوسط، وأكثر من 200 جين في الأب العالي في الضبط الاسموزي 62266 IR واكتشاف 69 جين Up - regulated تعمل تحت ظروف الإجهاد في السلالات عالية الضبط الاسموزي ، وقد افتقدت السلالات منخفضة الضبط الاسموزي إلى 9 من هذه الجينات. ويتحكم أربعة من هذه الجينات في تخليق السكروز، والبروتين ومقاومة الصدمة الحرارية مؤكداً دورها الحيوي في المحافظة على الضبط الاسموزي العالي وثبات الأغشية (2005 ,.Hazen et al) .
كما أمكن تمييز أحد معلمات الصفة الكمية QTL يزيد من عدد الأيام من الزراعة حتى التزهير في نباتات الأرز غير المعرضة للإجهاد، يؤثر على الحجم والوزن الجاف للجذور تحت ظروف الإجهاد (2002 .Venuprasad et al). كما فسرت خمس معلمات للصفة الكمية 50% من التباين في كمية المحصول وتحديد طرز مختلفة للفعل الجيني للمواقع المسئولة عن تحمل الجفاف والمحصول في الذرة الشاميةAgrama and Moussa 1996 ، وفى تعيين المواقع الوراثية المؤثرة في محتوى حمض الابيسيك في أوراق 80 عائلة في الجيل الرابع للهجين بين السلالة 420 Os عالية المحتوى من حمض الابسيسيك × السلالة 78 IABO المنخفضة في محتوى حمض الابسيسيك في مرحلة الاستطالة قبيل الإخصاب تحت ظروف الجفاف في الحقل. وارتبط 4 معلمات للصفة الكمية معنوياً مع المحتوى المنخفض للحمض، مثلت 66% من التباين المظهري و 76% من التباين الوراثي بين العائلات، وكانت مساهمة الاليلات المزيدة للحمض راجعاً إلى السلالة 420 Tuberosa et al., 1998) Os).
إضافة إلى ما تقدم، فقد أفادت تقنية QTLS في تحديد 13 موقع جينومی ارتبطت مع واحد أو أكثر من قياسات تحمل الجفاف في مرحلة ما بعد التزهير في الذرة الرفيعة، وتمييز عديد من المواقع المرتبطة بمعدل وفترة امتلاء الحبوب، حيث ارتبط معدل امتلاء الحبوب العالي وفترة امتلاء الحبوب القصيرة مع حجم الحبوب الكبير. وتلازم موقعين مع الاختلافات في ثبات متوسط السلوك تحت ظروف الجفاف (Tuinstra et al 1997) .
وتشير النتائج إلى أهمية استخدام المعلمات الجزيئية كمساعدات للانتخاب في مجموعة سيل لتحمل الجفاف.
تقنية نقل الجين Gene transfer technology
لقد تمكن باستخدام التقنيات الحديثة وطرق نقل الجينات الحصول على نباتات تتحمل إجهاد الجفاف، إذ تمكن معهد بحوث النبات بكاليفورنيا بالولايات المتحدة الأمريكية من نقل صفة مقاومة الجفاف من أحد النباتات الصحراوية والتي ثبت أنها أحد الاصول الوراثية للقمح المنزوع إلى الأصناف الجيدة عالية المحصول من القمح عن طريق نقل المادة الوراثية والتي يمكن نقلها أيضاً إلى أي محصول نجيلي آخر من محاصيل الحبوب .
كما نجح العلماء المصريون في إنتاج قمح معدل وراثياً متحمل للجفاف عن طريق نقل جين " HVAL1" من الشعير، حيث تميزت النباتات الناتجة بزيادة المحصول وارتفاع النبات في اختبارات التقييم في الصوبة والحقل مقارنة بالصنف المحلى. وأوصت الدراسة بأهمية إدخال هذه التراكيب الوراثية في برامج التربية لتحمل الجفاف في منطقة حوض البحر الأبيض المتوسط، وكذا في غزو الصحراء (2004 ,Bahieldin).
كما نجحت بعض المجموعات البحثية في الهند في تحديد جينات معينة لها أدوار معروفة في زيادة تحمل الظروف البيئية القاسية. فقد أمكن تعيين عدد من الجينات المتحكمة في تخليق مختلف الذائبات المتوافقة مثل الجين mtl للمانيتول؛ والجين P5 CSF 129A أو P5CS للبرولين، والجين beta /bet B أو codal cox للجلايسين بیتاین؛ والجين tps1 للتريهالوز Trehalose والجين int1 لـ د - أونونيتول D - ononitol ، والإشارة إلى أهميتها في تحسين تحمل نباتات المحاصيل للإجهاد البيئي غير الحيوي. وقد حققت هذه المجموعة البحثية تقدماً في مجال تحسين تحمل صنف الكانولا Brassica Tuncea Pusa Jaikisan للملوحة والجفاف والحرارة المنخفضة عن طريق نقل جين cada Arthrobacter globiformic باستخدام بكتريا Agrobacterium tumefaciens كوسيط انتقال (الشكل التالي) . كما أمكن إنتاج سلالات من الحمص والعدس والفول السوداني والذرة الرفيعة والخردل معدلة وراثياً بجينات code و 1294 P2 CSF و mtld و tps1 تتحمل الإجهاد الاسموزي (2003 ,Sharmila and Saradhi)، وهجن من قصب السكر معدلة وراثياً بجين تخليق التريهالوز Tsase مقاومة للإجهاد الاسموزي (Wang et al., 2003b) .
وأمكن التعرف على خمسة جينات لتحمل الجفاف في الفول السوداني تم عزلها وتحميلها على حوامل Vectors ونقلها إلى الأصناف الحساسة والحصول على 16 توليفة وراثية، تميز أربع منها بوجود جينات مختلفة لتحمل الجفا (2003 Shakar et al., ).
جينات/ بروتينات ينظم فعلها بظروف الإجهاد البيئي :
Gensef proteins regulated by environmental stress
يعتبر تتبع سلسلة التغيرات الكيموحيوية والجزيئية المؤدية إلى تحسين تحمل الجفاف من الأمور الهامة عند دراسة الأساس الجزيئي لأقلمة التراكيب الوراثية لتحمل الجفاف.
شكل يبين: خطوات هندسة نباتات المحاصيل مقاومة للإجهاد باستخدام الاجروبكتريم
ففي الشعير ، أمكن تحديد عديد من الجينات التي ينظم (يتغير) تعييرها بالحرارة المنخفضة وأحياناً بالجفاف وقد أمكن عزل بعضاً من هذه الجينات من جينوم الشعير، وتحديد أثنين من سلالات دنا المكمل cDNA clones هما 93 paf و 29 cdr. كما لوحظ أنه خلال المراحل المبكرة من الجفاف يحدث تعبير لحمض mRNAs الرسول قبيل حث الجينات المنظمة المعروفة والمسئولة عن إنتاج حمض الايسيسيك ABA تحت تأثير الإجهاد الرطوبي.
وفى سياق التحكم الجيني يأتي دور تعبير جين annexin والموجود في عديد من الأنواع النباتية، كالأرز والارابيدوبسيس، في تحمل الإجهاد الرطوبي تحت ظروف الزراعات المطرية. حيث يمثل جين annexin عائلة من 13 تمايزاً distinct في أصناف الأرز الهندية المنتخبة تحت مستويات مختلفة من الإجهاد. ولوحظ أن هذا الجين يرتبط تركيبياً بالكالسيوم Ca+2، ويعتمد على بروتينات مرتبطة بالغشاء الخلوي مع فوسفوليبيدات متخصصة. وفى نبات الارابيدوبسيس أمكن تمييز وعزل وكلونة 7 أعضاء من عائلة جين annexin ، تنتشر في البروتينات الخلوية وخاصة السيتوبلازم والأغشية الخلوية والنواة، وأتضح دورها في تحمل الإجهاد في النبات ( Barthakur and Bansal, 2003) .
إضافة إلى ما تقدم ذكره، فقد تأكد وجود مواد حماية Protective substances عبارة عن بروتينات مرتبطة بالإجهاد، قادرة على حماية التركيب الخلوي ونشاط البروتينات الوظيفية الأخرى وتدعيم نمو النبات تحت ظروف الجفاف، سميت Plant chaperone - like stress - associated proteins (SP, and related proteins) مشابهة للبروتينات المرتبطة بمقاومة المسببات المرضية (2003 ,.Wang et al) .
كما ثبت وجود بروتينات فريدة مرتبطة بتحمل الجفاف في النباتات الراقية مثل (Peptidy prolyl cis-trans isomerases (PPIsases ، وقد أمكن عزل ونسخ مختلف جينات PPIsases من النباتات الراقية، وحث تعبير عديد منها بمختلف الإجهادات البيئية، وتأكد دورها من خلال تأثير الإجهاد المائي على النشاط الكلي لـ PPIsases في صنفين من الذرة الرفيعة مختلفين في تحمل الجفاف. حيث ازداد معنوياً نشاط PPIsases الكلى في أنسجة الصنف المتحمل للجفاف مقارنة بالصنف الحساس. وأعزى نشاط PPIsases في الأنسجة المختلفة إلى وجود كل من Cyclophilins و FK 506 - binding proteins . ويشير ذلك إلى وجود مسارات تنظيمية مختلفة في أصناف الذرة الرفيعة المتباينة في تحملها للجفاف (2003 ,Singh and Sharma) .
جـ- تقنية زراعة الأنسجة Tissue culture technology
تفيد مزارع الأنسجة في دراسات تحمل الجفاف وإجراء الانتخاب على مستوى القوارير أو بيئات الزراعة in vitro selection ، حيث يمكن تجنب كافة العوامل التي يصعب التحكم فيها تحت الظروف الحقلية والتي قد تؤثر في استجابة التراكيب الوراثية لظروف الجفاف من خلال الضبط الاسموزي ويلعب استخدام محدثات الاسموزية Osmoticums مثل البولي إيثيلين جليكول PEG ، والمانيتول و Carbowax دوراً هاماً في تحقيق هذا الغرض.
فقد أشارت الدراسات، أن إضافة البولي إيثيلين جليكول لبيئة الزراعة له علاقة بزيادة قدرة خلايا الكالوس النامي على هذه البيئات على الاحتفاظ بالماء Water retaining capacity مما يزيد من قدرة الخلايا على تحمل الإجهاد المائي، ومن ثم إمكانية استيلاد نباتات وعزل تراكيب وراثية مقاومة للجفاف.
وقد أفادت هذه التقنيات في غربلة ثماني تراكيب وراثية من الذرة السكرية للجفاف
هي 4418 NN ،Willey ,Roma ,Rio ,S 301 ، MN 1060 ,Tracy , S 405 ، لإمكان زراعتها في الأراضي المستصلحة حديثاً من خلال الاستجابة لتكوين الكالوس ، حيث تم فصل الأجنة من البذور وزراعتها على أربعة بيئات مختلفة في المكونات وفي تركيز هرمون -2,4-D وتركيز الفيتامينات وهي LS - 2, MS - 1, MS-2, LS-1 واستخدمت تركيزات مختلفة من البولي إيثيلين جليكول هي صفر، 9، 12، 15 % في اختبارات تحمل الجفاف. حيث أظهرت الأصناف الثلاثة 1060 ,MN 1418 ,MN Rio نسباً عالية في صفات استحداث الكالوس، ووزن الكالوس والكالوس الجنيني وتكوين النمو الخضري، ثم استكمل Makhlouf ومعاونوه (2002) تجاربهم باختيار أنسب بيئة وهي LS-1 وتنمية أجنة الثلاثة أصناف المتميزة عليها في وجود البولي إيثيلين جليكول لمدة 28 يوم. حيث أظهرت النتائج أن أكثر الأصناف تأثراً بالمادة الصنف 4418 MN ، في حين كان الصنف Rio أقل تأثراً.
وتفيد التباينات الجسدية Somaclonal variation الناتجة في مزارع الأنسجة في عزل سلالات خلايا تتحمل ظروف الشد الرطوبي. فعند تنمية كالوس أقماح الديورم في بيئة تحتوي على البولي ايثيلين جليكول 10000 كمحدث للاسموزية، أمكن استيلاد 13 نبات من 30 نبات، كانت أكثر تحملاً للجفاف. وباستخدام قياسات استشعاع الكلوروفيل والتسرب الالكتروليتي للأوراق تحت ظروف الإجهاد المائي، أتضح أن تطبيق الإجهاد الاسموزي خلال مرحلة الاستيلاد كان فعالاً في الانتخاب لتحمل الجفاف (1994 ,Hsissou and Bouharmont) . ويبين الشكل التالي بعض سلالات القمح المتباينة في الطول ووجود السفا والناتجة من مزارع الأنسجة Pochlman and Sleper., 1996)) .
كما أفاد تكنيك زراعة المتوك Anther culture في إنتاج سلالات من الأرز ثنا أحادية Doupled - haploid متميزة في صفات كفاءة استخدام الماء ومعدل النتح المرتبطة بتحمل الجفاف (2003 Nadaradjan et).
شكل يبين: التباينات الجسدية في القمح. تظهر الآباء على الجانيين وبينهما السلالات الناتجة من مزارع الأنسجة والمتباينة في الطول ووجود السفا
