المكونات الرئيسية للبيئة الغذائية المستخدمة في الزراعة النسيجية
تحديد المكونات الرئيسية للبيئة الغذائية
تحتوي البيئة الغذائية على حوالي 20 مركبا. وتتكون أساسا من ماء وسكر وعناصر معدنية ومنظمات نمو (جدول 1) ويفضل الرجوع إلى الدراسات السابقة لتحديد البيئة المناسبة للنبات تحت الدراسة بدلا من إجراء سلسلة اختبارات لتحديد البيئة وتركيز كل مكون فيها، وقد يستغرق ذلك فترة زمنية طويلة. لذلك يجب أن تبدأ التجارب الأولية بثلاثة تركيزات (منخفض، متوسط، مرتفع) على عناصر البيئة للنبات تحت الاختبار كالآتي:
- السكروز يحضر عادة بتركيزات 1% و 2% و 4% .
- العناصر المعدنية : تستخدم بيئة 1962 (Murashige and Skoog (MS كأساس تحضر منها تركيزات 25% و 50% و 100% من قوة العناصر المعدنية المذكورة بها.
- الأكسينات مثل (IBA) Indole-3- Buty Acid ويحضر بتركيزات 0,01 و 0.5 و 5 ملليجرام / لتر.
- سيتوكاينينات مثل : (Benzydenine (BA-6 وتحضر بتركيزات 0,01 و 0.5 و 5 ملليجرام / لتر.
فإذا كان المطلوب إجراء تجارب أولية على 4 عوامل هي : السكروز والعناصر المعدنية و (IBA) و (BA) . ويحضر من كل مركب في ثلاثة تركيزات فيكون عدد التراكيب المطلوب تحضيرها هي 43 = 81 تركيبة. لذلك تجرى تجارب زراعة الأنسجة على 81 تركيبة غذائية. واختيار أفضلها من حيث تأثيرها على سرعة النمو وجودته. وبهذا يتم الوصول إلى الهدف في أقصر فترة ممكنة. وقد يستلزم إجراء مزيد من الاختبارات لتحديد التركيز الأمثل من الأكسين أو السيتوكاينين. فإذا ثبت من التجربة الأولى أن أفضل تركيز مثلا هو 0,5 ملليجرام / لتر. فيفضل إجراء سلسلة اختبارات أخرى تحتوي على تركيزات أقل وأعلى من 0.5 مثل 0.1، 0,3، 0,5، 0,8 ، 1 ملليجرام / لتر. وقد يستلزم إجراء سلسلة اختبارات أخرى إذا تغير نوع المحصول.
جدول (1) المكونات الرئيسية للبيئات الغذائية المستخدمة في الزراعة المعملية
أهمية مكونات البيئة الغذائية
1 - الماء Water
الماء من اهم المركبات في البيئة الغذائية لأنه الوسط الذي تذوب فيه جميع المكونات، ويستلزم استخدامه في صورة مقطرة ومعقمة بدرجة عالية، ويفضل استخدم جهاز من الزجاج البيركس Pyrex لتقطير الماء مرتين، خصوصا لمزارع البروتوبلاست والخلايا الفردية والأنسجة المرستيمية. ويجب تنظيف جهاز التقطير من الداخل بصورة منتظمة للتخلص من الرواسب والشوائب العالقة بالجهاز والمحافظة على جودة الماء المقطر. ويلحق بجهاز التقطير جهاز مزيل للأيونات De ionizer . ويفضل البعض استخدام أغشية أسموزية لترشيح وتنقية الماء المقطر بهدف مزيد من النقاوة والتعقيم ويخزن الماء المقطر في أوانٍ من البوليثين Polytheme ، حيث يمكن أن تنطلق من جدر الأواني الزجاجية إلى الماء المقطر آثار من الرصاص والصوديوم والزنك التي يحتويها الزجاج كشوائب. وإذا كان لابد من استخدام الزجاج لتخزين الماء فيجب أن يكون من النوع البيركس .
2 - السكر Sugar
السكروز من المركبات الهامة جدا الذي يتم تمثيله طبيعيا في النبات. ولابد من تواجده في البيئة الغذائية لأهميته كمصدر للطاقة في تكوين النموات الجديدة. وترجع أهميته إلى عدم كفاءة النباتات المعملية في بناء السكريات نتيجة ضعف الكلوروفيل وضعف الإضاءة أو إطالة فترة الظلام التي تتعرض لها النباتات المعملية أحيانا مما يساعد على توقف البناء الضوئي تماما كما أن تركيز ثاني أكسيد الكربون الناتج عن تنفس النباتات المعملية يكون محدوداً وغير كاف لعملية التمثيل الضوئي ( George,1993، Pirik, 1997 ). ومن الناحية العملية يصعب إمداد البيئة بغاز ثاني أكسيد الكربون، وزيادة تركيزه داخل الأواني المزروعة يؤدى إلى تسمم النباتات. ويضاف السكروز للبيئة بنسبة 1 – 5 %. وقد يستخدم الجلوكوز والفركتوز والمالتوز والجالاكتوز والسكريات الكحولية مثل الجلسرول والسوربيتول. ويعتمد تركيز السكروز المضاف للبيئة على نوع وعمر النبات النامي. فالأجنة الصغيرة جدا تحتاج إلى نسبة عالية من السكروز، وزيادة تركيز السكروز في البيئة عن التركيز الأمثل يؤدى إلى تدهور النموات نتيجة تثبيط عملية التمثيل الكربوني وتثبيط تكوين الكلوروفيل والسكروز المتوفر في السوبر ماركت مناسب لارتفاع نقاوته إذ يحتوي على 99,94% سكروز و 0,02 % ماء و 0,04٪ سكريات أخرى مثل الفركتوز والجلوكوز. وتعقيم البيئة بالأوتوكلاف قد يحدث تغييرات للسكريات. كما أن زيادة رقم حموضة البيئة عامل هام في إحداث هذه التغيرات وتساعد زراعة أجزاء جذرية في البيئة على إحداث تغيير في السكروز نتيجة نشاط إنزيم الإنفرتيز Invertase المفرز من خلايا الجذر. واختلفت آراء الباحثين حول تأثير تعقيم السكر بالأوتوكلاف. ويستخدم السكروز في زراعة البروتوبلاست للمحافظة على الضغط الأسموزي للبيئة الغذائية وحماية البروتوبلاست من الانفجار. ويضاف السوربيتول Sorbitol أو السكروز بتركيز 023 مولر للمحافظة على البروتوبلاست في البيئة الغذائية. ويعتبر السوربيتول أفضل مصدر للكربوهيدرات في البيئات الخاصة بزراعة أنسجة نباتات العائلة الوردية Rosaceae. ويستخدم السكروز بدلا من السوربيتول مع بعض الأنواع التابعة للعائلة الوردية. ومن ناحية أخرى تنمو أنسجة بعض النباتات مثل الخوخ صنف Reliance في وجود السوربيتول بصورة أفضل بالمقارنة بالسكروز .
3- الأملاح المعدنية Mineral salts
تشمل الأملاح المعدنية على العناصر الضرورية الكبرى وهي النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم والكالسيوم والماغنسيوم والكبريت ونقصها يسبب موت النبات. والعناصر الضرورية الصغرى وهي الحديد والمنجنيز والنحاس والزنك والبورون والموليبدنم والكلور والكوبالت ويؤثر نقصها على انتظام سير العمليات الحيوية في النبات، ولا تكون سببا مباشرا في موت النبات.
وتعتبر بيئة (1962) (Murashige and Skoog (MS من أكثر البيئات استعمالا في الزراعة المعملية وتستجيب لها معظم النباتات بسهولة. وقد تكون بيئة (MS) غير مناسبة لنمو بعض النباتات ذات الحساسية الشديدة للتركيزات المرتفعة من العناصر مثل نباتات Rhododendron; Gerbera; Kalmia وبعض النباتات الخشبية، لذلك قد تستخدم تركيزات مخففة من بيئة (MS) أو تستخدم بيئة أخرى منخفضة في العناصر المعدنية مثل بيئة Lloyd and Mc Cown, 1980; Woody Plant Media) WPM). Grattapaglia and Machado, 1998). ويفضل تحضير الأملاح باستخدام تركيز الأيونات بالملليمولر. وتتعدد البيئات وتختلف في محتواها من العناصر بما يتناسب مع اختلاف حساسية النباتات تحت التجربة. وتعتبر بيئة (MS) غنية في الأملاح، بينما بيئة Knops فقيرة فيها، ويحتاج النبات 2-26 ملليمول/ لتر بوتاسيوم، و1 - 5 ملليمول / لتر من كل من الفوسفات (H2PO4-) والكالسيوم (Ca+++) والماغنسيوم (Mg++) والكبريتات .(Suo4-). ويعتبر الحديد من العناصر الهامة في البيئة لتأثيره المباشر على نمو وتكشف الأجزاء النباتية المزروعة. ويجب تواجد الحديد والعناصر المعدنية الأخرى في صورة قابلة للامتصاص. مع العلم بأن أملاح الحديد في صورة سترات Citrate و طرطرات Tartrate صعبة الذوبان في الماء وترسب بعد تحضيرها في البيئة الغذائية. بينما تميزت بيئة (MS) بوجود الحديد في صورة مركب Fe-EDTA، وهو من المركبات المخلبية المفضلة بالمقارنة بأملاح الحديد الأخرى لأهميته في تنشيط تكوين الأجنة والنموات، ويؤخذ عليه عدم الثبات في البيئة بعد تعقيمها بالأوتوكلاف حيث يتحد مع مركبات أخرى ويرسب بعد عدة أيام. لذلك يفضل عليه مركب FeNa - EDTA لاحتوائه على الحديد والصوديوم.
ويضاف النيتروجين إلى معظم البيئات في صورة أمونيا (NH4+) أو نترات (NO3). فإذا كانت كمية النيتروجين المطلوب إضافتها للبيئة 12 - 60 ملليمولر فيجب أن يكون تركيز الأمونيا ما بين 6 - 40 ملليمولر. وتمتص معظم النباتات النترات بصورة أفضل من الأمونيا، بينما تمتص بعض النباتات الأمونيا بصورة أفضل من النترات. وامتصاص النبات لأيونات الأمونيا يؤدى إلى انخفاض رقم حموضة البيئة وإسالة الآجار ويؤدى بالتالي إلى امتصاص النيتروجين في صورة نيتريت (Nitrite (NO2 وفى أنواع نباتية عديدة وجد أن للنيتروجين المختزل تأثيره واضحا على نمو الأجزاء النباتية في المعمل، وأن أيون الأمونيا (NH4) في صورة كلوريد أمونيا NH4CI أو نترات أمونيا NH4NO3 يحقق نموا جيدا لكالس نباتي الكمثرى والتفاح. وإضافة الأحماض الأمينية وخاصة الأسبرجين Asparagine أو الجلوتامين Glutamine إلى البيئة في وجود الأمونيا لم يُعْطِ أية زيادة ملحوظة في النمو 1970 ,.Nich et al ويدخل النيتروجين في تركيب الأحماض الأمينية والبروتين والكلوروفيل والأحماض النووية (RNA DNA). ويدخل النيتروجين في تركيب الإنزيمات التي تعتبر عاملا حيويا هاما تزيد من سرعة التفاعلات الحيوية بالخلية النباتية، ويدخل في كثير من الهرمونات النباتية مثل الأكسينات التي تحتوى على حلقة الإندول مثل (IAA) والسيتوكاينينات مثل الكاينتين (KIN) والبنزايل أدينين (BA). ويساعد الأكسين على نمو النباتات وتكوين الجذور وكسر السكون وينشط السيتوكاينين تكوين الأفرع والتكاثر وزيادة عدد النباتات.
ويدخل الفوسفور في تكوين الفوسفوليبيدات والأحماض النووية ومركبات جلوكوز -1- فوسفات وأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) وأدينوزين ثنائي الفوسفات (ADP) وأدينوزين أحادي (AMP) وجميعها مركبات تمد الخلية بالطاقة. بينما يدخل الماغنسيوم في تركيب الكلوروفيل ويعمل على زيادة اللون الأخضر في النبات. وغيابه يؤدى إلى اصفرار النباتات ولا تستكمل دورة حياتها. ويؤدي نقص الكالسيوم في النبات إلى عدم تكوين الصفيحة الوسطى Middle lamella أثناء انقسام الخلية واصفرار النبات وإصابة القمة النامية بالقرح Necrosis وظهور ظاهرة التزجج Vertification في النباتات المعملية ولا يستطيع النبات استكمال دورة حياته في غياب عنصر الكالسيوم والبوتاسيوم من العناصر الضرورية للنبات لأنه يساعد على امتصاص الماء وانتقال السكريات ولم يعرف حتى الآن المركبات التي يدخل البوتاسيوم في تركيبها. ويؤدى غياب البوتاسيوم كلية إلى فقد النبات قدرته على تكملة دورة حياته والكبريت من العناصر الضرورية ويدخل في تركيب بعض الأحماض الأمينية مثل السيستين والسيستائين والميثيونين وجلوتاثيون ويساعد الكبريت على إتمام تفاعلات الأكسدة والاختزال ولا يستطيع النبات تكملة دورة حياته في حالة غيابه كليا.
4 - الآجار Agar
يستخلص الآجار من حشائش البحر Seaweeds في صورة حبيبات Pellets. ثم ينظف وينقى للتخلص من المواد السامة. ويوضح جدول (2) محتوى بعض أنواع الآجار من الشوائب العضوية وغير العضوية ويستخدم الآجار كمادة غروية في معظم البيئات الغذائية والآجار من مشتقات السكريات المتعددة Polysaccharides ذات الوزن الجزيئي الكبير. وله القدرة على ربط جزيئات الماء فيحول البيئة السائلة إلى غروية. ويخفض ظاهرة التزجج نتيجة انخفاض نسبة الرطوبة الممتصة. ويضاف آجار Difco Bacto Agar إلى البيئة الغذائية بتركيز 0,6 - 0,8 %. وللآجار القدرة على الارتباط بجزيئات الماء وادمصاص المركبات الكيميائية بالبيئة وزيادة تركيز الآجار إلى 1% في البيئة يؤدى إلى تصلب البيئة جدا ويصعب ثبات الجزء النباتي عليها نتيجة انخفاض الماء الميسر بالبيئة الغذائية مما يؤخر تكوين الجذور وانخفاض التلامس بين المادة النباتية والبيئة الغذائية مما يؤدى إلى انخفاض قدرتها على امتصاص الماء والعناصر الغذائية. وإذا استخدم الآجار بتركيز أقل من 0,4 % تصبح البيئة غير متماسكة Sloppy خصوصا إذا كان رقم الحموضة منخفضا أيضا. بينما إذا استخدم التركيز 0,6 % وظلت البيئة غير متماسكة لذلك يجب الرجوع إلى تصحيح حموضة البيئة ، لأن رقم الحموضة إذا كان أقل من 4,5 - 4,8 يؤدى إلى عدم تماسك البيئة. ومضمون ذلك أن نمو المادة النباتية يتأثر بنوع الآجار وتركيزه، لذلك يفضل استخدام آجار نقي وعالي الجودة. ويوضح جدول (3) محتوى أجار Difco من العناصر. وبالرغم من وجود أنواع أخرى معروفة من الآجار مثل Flow Magar Gibco phytagar إلا إنه يفضل زراعة البروتوبلاست أو الخلايا الفردية في آجار نقية جدا مثل الأجاروس Agarose. ويمكن استبدال الآجار بمركبات أخرى مثل:
- البوليمرات الصناعية Synthetic polymers مثل البيوجيل .Biogel وهو عبارة عن حبيبات بولي أكريليميد Polyacrylamide pellets.
- الجينات الصوديوم Sodium alginate ويستخدم في زراعة البروتوبلاست . ومواد من السليولوز المتبلور (Cellulose crystallite aggregate (CCA ولها أهمية خاصة في تكوين جذور القنبيط .
- معقد الجيل رايت Gelrite وهي مادة غروية عالية النقاوة، تتكون من سكريات عديدة مثل الجلوكورونيك Glucuronic والجلوكوز والرامنوز Ramnose وأرثو أسيتيل ميوتيز O-Acetyl moietics. ومعقد Gelrite قادر على تكوين جيل لامع في وجود ملح المائدة. وتعتمد قوة هذا الجيل على نوع الملح المضاف. فالكاتيونات الثنائية مثل الماغنسيوم (%0.1 سلفات ماغنسيوم MgSO4. 7H2O) والكالسيوم تعطى جيلا أقوى من الجيل المضاف إليه أيونات أحادية التكافؤ مثل الصوديوم أو البوتاسيوم. ويحتاج Gelrite إلى حرارة وتوفير كاتيونات ليكون القوام غرويا، ويوصى باستخدام 0٫2٪ جيل رايت. ويؤخذ عليه أنه يحتوي على آثار من مركبات فينولية قد تسبب سمية للنموات الناتجة في المعمل.
- مادة نشوية تستخلص من نبات Nephrolcpis exaltata تستخدم بتركيز 12 جرام / لتر بيئة، وتذوب في الماء بدون استخدام حرارة.
جدول (2) محتوى بعض أنواع الآجار من الشوائب العضوية وغير العضوية
جدول (3) محتوى Difco Bato Agar من العناصر
5- معقدات طبيعية Natural complex
هي معقدات طبيعية مثل عصائر الطماطم والبرتقال والعنب والأناناس وماء جوز الهند والموز المهروس ومستخلص الخميرة ومستخلص المولت، وتحتوي هذه المعقدات ومستخلصاتها على تركيزات عالية من السكروز وعناصر غذائية ومركبات هامة أخرى يستلزم دراستها لمعرفة مكوناتها وعلاقتها بتنشيط النمو. فقد وجد أن زراعة أنسجة مفصولة من نباتات الموالح على بيئة مضافا إليها ٪10 عصير برتقال قد نمت بكفاءة تعادل ستة أضعاف مثيلتها التي لا تحتوي على عصير برتقال، وتعادل مثيلتها التي تحتوي على ٪10 سكروز (1978 ,Einset). كذلك ثبت أن ماء جوز الهند يحتوي على مركبات عديدة مثل Myoinositol الذي يدخل في تركيب البينات الغذائية كمنشط للنمو، ويدخل أيضا في بناء الفوسفوليبيدات والمواد البكتينية في الجهاز الخلوي وفى بناء الغشاء البلازمي. ويضاف Myoinositol إلى بيئة أنواع نباتية عديد مثل البلارجونيوم Pelargonium hortorum بتركيز 50 - 100 ملليجرام / لتر ، ويعتبر هاما جدا لنمو كالس نبات Faxonus pennsylvanica وتكشف كالس نبات Hawoethia. ويساعد ماء جوز الهند على نمو وتكشف الأنسجة النباتية المزروعة في المعمل لأنواع نباتية عديد مثل أجنة نبات الداتورا ونخاع نبات التبغ ومرستيم القمة النامية لنبات Pharbitic nil. ويحتوي ماء جوز الهند على مركبات عديدة لها أهميتها في انقسام الخلايا مثل Diphenylurea والسيتوكاينين الطبيعي Zeatin ومركب مشابه للكينيتين (KIN) وهو أحد مركبات السيتوكاينينات. كما يحتوي على العديد من الأحماض الأمينية الحرة مثل فينيل الآنين Phenyl alanine الذي له دور فعال في انقسام خلايا نبات فول الصويا. ويضاف ماء جوز الهند للبيئة الغذائية بمعدل 50 - 150 ملليلتر / لتر (3 - 15%) . وتعتمد الكمية المضافة من ماء جوز الهند على عمر الثمرة حيث يتغير تركيبه بتقدم عمر الثمرة. وإضافة ماء جوز الهند مع الأكسينات للبيئة الغذائية يؤدى إلى انقسام سريع للخلايا. كذلك ثبت أن ماء ثمار جوز الهند الناضجة يحتوى على سيتوكاينين يسمى -9-β-Ribofura- nosylzeatin ولذلك يستخدم السيتوكاينين في حالة عدم توفر ماء جوز الهند. كما يحتوي على نيتروجين مختزل له تأثير منشط قوى لنمو الأنسجة النباتية المختلفة. ويستخلص ماء جوز الهند بثقب الثمار بواسطة مثقاب كهربائي. ويجمع الماء من كل ثمرة على حدة في كأس مستقل. ويختبر السائل للتأكد من صلاحيته. ثم يجمع الماء من الثمار السليمة ويرشح خلال شاشة جبن. ويعقم الراشح بالأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة عند 121 م ثم يترك ليبرد طول الليل. ثم يرشح في صباح اليوم التالي، ويحفظ في وعاء بلاستيك ذات غطاء قلاووظ عند 20 م.
6 - معقدات طبيعية أخرى
تستخدم بعض المعقدات الطبيعية الأخرى كمصادر للنيتروجين حيث تحتوي على أحماض أمينية وفيتامينات مثل كازين Casein-hydrolysate ويضاف بتركيز 0.1-1 جرام / لتر . والبيتون Peptone ويضاف بتركيز 0.25 – 3 جرام / لتر. والتربتون Tryp-tone ويضاف بتركيز 0.25-2 جرام / لتر ومستخلص المولت Malt extract ويضاف بتركيز 0,5 – 1 جرام / لتر ومستخلص الخميرة Yoast extract ، ويضاف بتركيز 0.25 - 2 جرام/ لتر. وتستخدم الخميرة لاحتوائها على نسبة مرتفعة من فيتامين B .
7- معقدات متنوعة Miscellaneous compounds
( أ ) أمينات متعددة Polyamincs
تستخدم هذه المركبات لتشجيع خلايا الكالس على تكوين الأجنة. ومن هذه المركبات Putrescine; Spermidine; Spermine. ولوحظ زيادة مركبات Spermidinc Putrescine طبيعيا في أجنة نبات الجزر ونبات Medicago sativa أثناء نموها، وإضافة مثبط البولي أمينات Polyamines inhibitor يتوقف تكوين الأجنة، وبإضافة أي مركب من الأمينات المتعددة تستأنف الأجنة نشاطها. ويتواجد مركب Putres cine متزامنا مع بدء تكوين أجنة الجزر. وتساعد الأمينات المتعددة أيضا في تكوين الجذور العرضية. ومضمون ذلك أن الأمينات المتعددة والإنزيمات المرتبطة بنشاطها لها أهمية في انضباط النمو وتطوره، ولها أهمية كبيرة أيضا في حفظ الأنسجة والأصول الوراثية النادرة لفترات طويلة للاستفادة بها مستقبلا. ويبدو أن مركب - Putrescine مشتق من الحمض الأميني L-Arginine. وأن الأمينات المتعددة لها القدرة على منع تحويل الميثيونين Methionine إلى إيثلين Ethylene. والتوازن الداخلي بين الإيثلين والأرجينين والأمينات المتعددة له دور هام في انضباط تكوين الأجنة الجسمية (1986 Rugini and Wang,).
(ب) مركب فينايل يوريا ومشتقاته Phenylurea and its derivatives (DPU)
يعتبر مركب (DPU) مثبطا لإنزيم Cytokinin oxidase المؤكسد للسيتوكاينينات ، لذلك يعمل (DPU) على زيادة نشاط السيتوكاينينات (Horgan1986). ويعتبر إنزيمي Thidiazol ureas (Thidiazuron); Pyridyl ureas ومشتقاتهما من أكثر المركبات نشاطا وفاعلية، ويعادل نشاطهما 10 آلاف مرة قدر نشاط (DPU) كما أنهما أكثر نشاطا من الزايتين Zeatin (سيتوكاينين طبيعي). وينشط انزيم Thidiazuron نمو الأفرع لنباتات أشجار خشبية عديدة، ويؤدى تركيز 100 ميكرومولر من انزيم Thidiazaron إلى زيادة ملحوظة في عدد أفرع نبات Celtis occidentalis أكثر بالمقارنة بتركيز 4 - 10 ميكرومولر من مركب (Meyer and (BA) Kemsh1986). لذلك يجب أن تنال هذه المركبات اهتمام الباحثين.
(جـ) الأدنين Adenine
يضاف الأدنين في صورة سلفات أدين Adenine sulphate لسهولة ذوبانه في الماء ويضاف بمعدل 2 - 120 ملليجرام / لتر للبيئة سابقة التجهيز الموجودة في الأسواق (1948 Nitsch, et al., 1967; Skoog and sui. ويشجع الأدنين تكوين الأفرع على أجزاء نباتية متعددة.
8- الأكسينات والسيتوكاينينات
تعرف الهرمونات Hormons بأنها مركبات عضوية يتم تمثيلها في النباتات الراقية بصورة طبيعية. وهي مركبات يظهر أثرها المنشط والمنظم في النبات عندما يكون تركيزها منخفضا. وفي الأسواق الآن توجد منظمات نمو صناعية مماثلة للمركبات الطبيعية في تأثيرها الفسيولوجي (1997 ,Pircrik). ويطلق على المركبات الطبيعية والصناعية اسم منظمات نمو Growth regulators لأهميتها الكبيرة في تنظيم نمو النبات وتطوره وتوزيع المركبات الممثلة في النبات وانقسام الخلايا وزيادة عددها وحجمها وللأكسينات Auxin والسيتوكاينينات Cytokinin أهمية كبيرة في الزراعة المعملية ومن المستحيل نجاح زراعة الأنسجة في المعمل بدون منظمات نمو سواء كانت موجودة طبيعيا في النسيج أم مضافة للبيئة الغذائية. والاتزان بين منظمات النمو المضافة للبيئة ومنظمات النمو الموجودة طبيعيا في الجزء النباتي له أهمية كبيرة في تنظيم النمو وتكوين الشكل الخارجي للنموات. وعلى ذلك فالأجزاء النباتية التي تحتوى طبيعيا على قدر كاف من الأكسين أو السيتوكاينين لا تحتاج إلى إضافة مثل هذه المركبات إلى البيئة والأنسجة الحديثة Juvenile لها القدرة على الانقسام وإنتاج نموات جديدة بدون إضافة منظمات نمو للبيئة لاحتوائها طبيعيا على منظمات نمو بينما تحتاج الأنسجة البالغة Adult إلى إضافة منظمات نمو للبيئة لتنشيط خلاياها على الانقسام وطبقا لاحتياج النبات تقسم البيئات إلى بيئة يضاف إليها أكسينات فقط وبيئة يضاف إليها سيتوكاينينات فقط وبيئة يضاف إليها (اكسينات + سيتوكاينينات) وبيئة لا تحتاج إلى إضافة منظمات نمو. ويعتبر (1957 Skoog and Miller,) أول من أوضح العلاقة بين تركيز الأوكسينات والسيتوكايننات وأهمية التوازن بينهما في البيئة الغذائية وأثر ذلك على طبيعة نمو وتكشف الأنسجة المزروعة. وتختلف النسبة بينهما باختلاف النوع النباتي. ويتم التعرف إلى النسبة المثلى من خلال البحث والتجربة وتحتاج كثير من الأنسجة النباتية بشكل رئيسي إلى السيتوكاينينات في حين لا يعتمد البعض الآخر على وجودها. وقد تبين أن احتياج الأنسجة النباتية إلى السيتوكاينينات هي صفة وراثية. ويعتبر المعدل الطبيعي في جميع البيئات الأساسية لمزارع الأنسجة بالنسبة هو 0,5 ملليجرام / لتر سيتوكاينين + 5 ملليجرام / لتر IAA فإذا زاد تركيز الأكسين IAA يتكشف الكالس إلى جذور، وإذا انخفض تركيز الأكسين وزاد السيتوكاينين يتكشف الكالس إلى أفرع وأوراق جديدة ونبيتات جديدة ذات سوق وأوراق وجذور.
وعند تحضير البيئة تذاب الأكسينات IAA; IBA; NAA في الماء، وتكون أسهل في الإذابة إذا كانت في صورة ملح بوتاسيوم. ويمكن إذابتها أيضا في صورتها الحامضية في 0.1 مولر هيدروكسيد بوتاسيوم أو هيدروكسيد صوديوم. ويمكن إذابة السيتوكاينينات أيضا في 0.1 مولر هيدروكسيد بوتاسيوم أو هيدروكسيد صوديوم، بينما يذاب الجبرلين في الماء. وتخزن محاليل IAA والكينيتين في الظلام لأنها غير ثابتة في الضوء، بينما BA; 2,4-D ;NAA; IBA تكون أكثر ثباتا في وجود الضوء. ويفقد مركب IAA نشاطه في محلوله المائي تدريجيا بإطالة فترة التخزين كما يفقد نشاطه أيضا بواسطة إنزيمات البيروكسيديز Peroxidase والإندول أسيتيك أسيد أوكسيديز LAA-Oxidase.
8-1- الأكسينات Auxins
تضاف الأكسينات غالبا للبيئة لتنشيط نمو الكالس وتكوين الجذور العرضية. وتؤدى التركيزات المنخفضة من الأكسينات إلى تكوين الجذور العرضية، بينما التركيزات المرتفعة منها تمنع تكوين الجذور وتؤدى إلى تكوين الكالس وتثبط نمو السوق العرضية والإبطية لعدم قدرتها على كسر السيادة القمية، كما أنها تثبط تكوين الأجنة في معلق الخلايا وتعمل الأكسينات على استطالة الخلايا وانتفاخها وانقسامها وانتظام التكوين الظاهري للنموات خصوصا إذا كانت في اتزان مع السيتوكاينن .(1997 ,Pierik). وتتأثر الأكسينات كثيرا برقم الحموضة وكمية العناصر بالبيئة الغذائية. وتشمل الأكسينات العديد من المركبات أهمها:
-Indole Butaric Acid (IBA);3 3-Indole Acetic Acid (IAA);
3- 2,4,5-Trichlorophenoxy Acetic Acid (2,4,5-T); Naphthalene Acetic Acid (NAA);
2,4-2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid (2,4-D); 4,4-Chlorophenoxy Acetic Acid (CPA);
4-Amino- 3,5,6- Trichloropicolinic Acid (Pichloram or TCP)
ويعتبر (IAA) من الأكسينات الضعيفة ويتكون طبيعيا في النبات ويخلق صناعيا. ويضاف إلى البيئة بتركيز 0,01-1000 ملليجرام / لتر. وتعتبر الأكسينات الصناعية مثل NAA ; IBA ; -2,4-D)) من الأكسينات القوية وتضاف للبيئة بتركيز 0,001 - 10 ملليجرام / لتر (2001 ,.Torres et al) ويرشح مركب (IAA) قبل إضافته للبيئة الغذائية باستخدام مرشحات بكتيرية لأن تعقيمه بالأوتوكلاف يؤدى إلى تكسيره وتقليل فاعليته ويحفظ في زجاجات بنية لأنه يفسد بالضوء. كذلك تحفظ البيئة المحتوية على (IAA) في ظلام تام حتى لا تفسد فاعليته. وتعمل الإضاءة على تكسير هذا الأكسين في البيئة الغذائية بعد 14 ساعة من التحضين. كذلك يتأثر (IAA) بالحموضة والأملاح. ويلاحظ أن هذا الأكسين لا يذوب في الماء ويجب إذابته أولا في كحول إيثانول أو هيدروكسيد البوتاسيوم. ويحضر بإذابة 100 ملليجرام (IAA) في هیدروکسید بوتاسيوم تركيز واحد عياري ثم يكمل إلى 100 سنتيمتر مكعب بالماء المقطر.
ويستخدم (D-2,4) بتركيز عال كمبيد حشائش وبتركيزات منخفضة في مزارع الأنسجة للمساعدة على تكوين الكالس بالاتزان مع السيتوكينين. ويستخدم (D-2,4) في مزارع الأنسجة في نطاق محدود لأنه يساعد على إحداث الطفرات ويثبط أحيانا عملية التمثيل الضوئي، ولتجنب ذلك يوصى باستخدام مركب TCP بدلا من (D-2,4) بينما لا تسبب (IAA, NAA) هذه الآثار. وتختلف نباتات الفلقة الواحدة عن نباتات الفلقتين في استجابتها لتأثير (D-2,4). ويرجع ذلك إلى قدرة نباتات الفلقة الواحدة على امتصاص (D-2,4) وقدرة هذه المادة على تغيير السلوك الفسيولوجي حيث تمنع تكوين الصفيحة الوسطى Middle lamella وتتلفها أثناء انقسام الخلايا. وثبت أن الأكسين (CPA) هو الأقل تأثيرا بالمقارنة بالأكسينات (D, 2,4,5-T-2,4) وبمقارنة بالأكسين (IAA) وجد أن (D-2,4) يحفز النمو بمقدار 8 - 12 مرة، وأن (2,4,5-T) يحفز النمو بمقدار 4 مرات بينما (CPA) يحفز النمو بمقدار مرتين فقط.
ويستخدم الأكسين (NAA) بكثرة في مزارع الأنسجة النباتية لتكوين الكالس أو تكوين المجموع الجذري في المرحلة النهائية ، ويعتبر أقل تأثيرا من IAA من حيث القدرة على إيقاف أو منع تكشف الأجزاء النباتية والتركيزات المخففة من NAA تؤدى إلى تنشيط تكوين الجذور لبادرات العائلة Pierik, et al., 1984 Brme-liaceae. ويلاحظ أن الاتزان الداخلي للأكسينات والسيتوكينينات هو المحدد في جميع حالات نمو النبات.
ويذوب NAA في الإيثانول وهيدروكسيد البوتاسيوم، ويحضر بإذابة 100 ملليجرام من الهرمون في هيدروكسيد البوتاسيوم تركيز واحد عياري، ثم يكمل إلى 100 سنتيمتر مكعب في هذه الحالة يكون سنتيمتر واحد مكعب يعادل واحد (ملليجرام). بينما يذاب 2,4-D في كميات قليلة من هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) ويخفف المحلول بعد ذلك بإضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم المطلوب. وقد يستخدم مركب Dimethyl sulfoxide لإذابة الهرمونات فيه. وإندول حمض البيوتريك (IBA) من الأوكسينات الهامة المستخدمة على نطاق واسع في مزارع الأنسجة النباتية بهدف تكوين المجموع الجذري. وهذا الهرمون ثابت نسبيا بالمقارنة بمركب (IAA) ، حيث إنه يتحمل التعقيم ولا يتأثر بالحرارة أو الضوء ويذوب أيضا في كحول الإيثانول وهيدروكسيد البوتاسيوم. ويتم تحضيره مثل تحضير مركب IAA.
2-8- السيتوكينينات Cytokinins
السيتوكاينينات مركبات عضوية مشتقة من الأدنين Adenine (أمينوبيورين Aminopurine). ولها دور هام في انقسام الخلايا ونمو أنسجة النبات وتؤثر على العديد من العمليات الفسيولوجية مثل تأخير الشيخوخة Senescence للخلايا وتنشيط حركة العناصر المعدنية ونضج الكلوروبلاست وضبط التكوين المورفولوجي للنبات (2001 ,.Torres et al). كما أن للسيتوكاينين القدرة على تثبيط السيادة القمية وتنشيط نمو الأفرع الجانبية وكسر طور السكون، وتثبط نمو الجذور (George, 1993). ومن أكثر السيتوكاينينات استخداما Pierik, 1997) 2iP, BA,KIN). ويذاب الكاينيتين (KIN) في الماء، ثم يعقم في أوتوكلاف تحت ضغط بخاري واحد كيلوجرام / سم2 لمدة عشرة دقائق. ويذوب الكاينيتين و(BA) في قليل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 عياري. وتشمل السيتوكاينينات :
6-Benzyl Amino Purine (BAP); 6- Benzyl Adenine (BA); Isopentenyl ad- enine (IPA); 6- y-y- Dimethyl ally Amino Purine (2 ip); 6- Furfuryl- Amino Purine (Kinetin ).;
5-(4-Hydroxy- 3- Methyl- trans- 2- Butenylamino) Purine (Zeatin).
اهمية التوازن بين الاكسينات والسيتوكينينات
الاتزان بين الاكسين والسيتوكاينين مطلوب غالبا لانتظام تكوين السوق والجذور العرضية، ففي مرحلة الزراعة الثانوية يجب ان يكون مستوى السيتوكاينين اعلى من الاكسين، بينما ينشط تكوين الجذور اذا كان الاكسين في مستوى اعلى من السيتوكاينين، وقد يكون وجود السيتوكينين في البيئة غير ضروي احيانا Torres, et al; 2001))
شكل يبين تاثير توازن الاكسين: السيتوكاينين على النمو والتكشف
8-3- الجبرلين Gibberellins
يؤدى إضافة (الجبرنين + الأكسين) إلى استطالة الخلايا والسلاميات ونمو المرستيمات. ويضاف الجبرلين للبيئة لكسر سكون الأجنة والبراعم والبذور والدرنات وغيرها. ويثبط الجبرلين تكوين ونمو الجذور. وتضاف الجبريلينات GA7+GA3 لبعض مزارع الأنسجة، و(GA3) هو من أكثر المركبات استعمالا والجبريلينات حساسة جدا للحرارة حيث يؤدى تعقيمها بالأوتوكلاف إلى تحطيم 90٪ من نشاطها البيولوجي.
9- منظمات نمو أخرى
9-1- أوليجوسكارين Oligosaccharins
تدخل الأوليجوسكارين في تركيب جدد الخلايا وتنظم سرعة النمو وتكشف الجذور والأزهار ونمو البراعم الخضرية ولها أهمية في حماية النبات ضد بعض الأمراض وتغييرات الظروف البيئية.
9 -2- حمض الأبسيسيك (Abscisic acid (ABA
ثبت أن حمض الأبسيسيك له تأثير سلبي على مزارع الأنسجة وعلى نمو الكالس وتكوين الجنين.
9-3- الإيثلين Ethylene
الأجزاء النباتية هي المصدر الرئيسي للإيثلين المتجمع في أواني الزراعة، والأوعية البلاستيكية مصدر آخر للإيثلين. ويزداد تجمعه خلال الأيام الخمسة الأولى من الزراعة ثم ينخفض بعد ذلك. ويؤدى زيادة تجمعه إلى تثبيط نمو وتكوين الأعضاء النباتية. ووضع أنبوبة تحتوي على برمنجانات بوتاسيوم داخل وعاء الزراعة يؤدى إلى التخلص من حوالي 70٪ من الإيثلين، وللإيثلين دور هام في تكوين (Van Aartrijk, et al. 1986).
9-4- فلورو جلوسينول Phloroglucinol
هو مركب فينولي له تأثير مثبط لإنزيم IAA-Oxidase المسئول عن تحلل الأوكسين .IAA لذلك فإن له القدرة على تنشيط النمو وتكوين السوق. ويؤدى إضافة فلوروجلوسينول مع IAA إلى البيئة إلى تنشيط نمو الجذور.
9-5- مركبات فينايل يوريا Diphenyl urea compounds
تستخدم هذه المركبات بدلا من السيتوكاينينات بهدف تنشيط النموات الجانبية. حيث تقوم هذه المركبات بوقف نشاط إنزيم Cytokinin oxidase المؤكسد للسيتوكاينين. وبالتالي تحتفظ الخلايا بمستواها الداخلى من السيتوكاينين التي لها أهمية في عمليات التضاعف الكروموسومي.
10 - فيتامينات Vitamins
معظم النباتات قادرة على تمثيل الفيتامينات إلا إنه لم يدرس الاحتياج الفعلي للأجزاء النباتية من الفيتامينات. ويضاف واحد أو أكثر من الفيتامينات لتحفيز النمو. حيث ثبت أن حامض الفوليك وحمض (PABA) يحفزان النمو ولكنهما غير أساسيين في البيئة. وأن الثيامين Thiamine HCI أساسي لنمو كالس نبات التبغ. وحمض الأسكوربيك لا يحتاجه النبات ولكنه يشجع على النمو فقط في غياب أو انخفاض تركيز الثيامين ويضاف حمض الأسكوربيك كمركب مضاد للأكسدة وحماية الأجزاء النباتية من الاسوداد (جدول 4).
جدول (4) التركيز المناسب من الفيتامينات
11 - أحماض أمينية Amino acids
الأحماض الأمينية لها أهميتها إذا كان النبات غير قادر على بناء البروتين بالقدر الكافي لاحتياجه. ويضاف الكازين Casein hydrolysis للبيئة كمصدر للأحماض الأمينية بنسبة 0,05 - 0,1 %. ويضاف غالبا ;Tyrosine; Glycine; L-Asparagine L-Glutamine كمصادر إضافية للأمونيا بمعدل 100 ملليجرام/ لتر. وقد يضاف سلفات الأدنين Adenine sulfate إلى البيئة لتحسين النمو وتكوين الأفرع. ويضاف Biotin; Glycine كمصادر للنيتروجين العضوي.
12 الفحم النباتي النشط Activated charcoal
ينتج الفحم النباتي بتفحيم الخشب عند حرارة مرتفعة في وجود بخار الماء. ويحتوي الفحم على فراغات بينية دقيقة جدا تجعل مساحة المسطح الفعال به كبيرة وقادرة على ادمصاص جميع المواد السامة والغازات، ويحتوي الفحم النباتي على 95 - 99 % فحم نشط، لذلك يفضل الفحم النباتي عن الفحم الحيواني. ويفضل استخدام الفحم نباتي النوع 2186 .Merck No ، ويضاف للبيئة بتركيز 0.2 - 3 % (وزن/ حجم) ومن أهم مميزاته : إكساب البيئة لونا غامقاً فتصبح مناسبة لنمو الجذور وامتصاص:
- الصبغات السامة الملونة الناتجة من المركبات الفينولية مثل الميلانين وغير الملونة الأخرى.
- المواد السامة التي تفرزها الأجزاء النباتية المفصولة من الموز والأشجار الخشبية.
- المركبات العضوية مثل منظمات النمو والإيثلين والفيتامينات والحديد والزنك وغيرها.
- مركب (Hydroxy methyl furural (HMF الناتج من انحلال السكروز أثناء التعقيم.
- مركب فينيل حمض الخليك Phenyl acetic acid وحمض البنزويك Benzoic acid التي تنتجها النباتات النامية في المعمل.
- يساعد على انتظام وثبات رقم حموضة البيئة الغذائية.
ويضاف الفحم النباتي للبيئة كحافز لنمو وتكوين الأعضاء Organogenesis والأجنة Embryogenesis لأنواع عديدة مثل تكوين الأجنة من متوك الأنيمون Anemone والتبغ Nicotiana والفيوناريا Funaria والأوركيدات Orchids وأجنة نخيل البلح والقمم النامية لنبات الزنجبيل Ginger والبصل والجزر البري، بينما يعتبر مثبطا لنمو فول الصويا وكالس نبات التبغ (1983 Ammirato).
الاكثر قراءة في الزراعة النسيجية
اخر الاخبار
اخبار العتبة العباسية المقدسة
