تعقيم بيئة مزارع الانسجة النباتية

كما هو معروف تحتوي البيئة المستعملة في مزارع الأنسجة على العناصر الغذائية اللازمة للنمو بالإضافة إلى تركيز مرتفع من السكر، لذا فإنها وسط جيد لنمو الكثير من الكائنات الدقيقة ومن ثم تعقم البيئة في الاوتوكلاف بعد تحضيرها مباشرة وقبل توزيعها في أوعية الزراعة أو تعقم كلها ثم توزع في الأوعية. وغالباً يتم التعقيم على درجة 121م وضغط 1.5 كجم/سم2 لمدة 15 دقيقة ومن الضروري أن يطرد الهواء من الاتوكلاف عند بدء عملية التعقيم لأن الحرارة تنتقل في البخار أسرع من الهواء. ويختلف الوقت اللازم لوصول البيئة إلى درجة حرارة التعقيم باختلاف حجم البيئة ويوضح جدول رقم (1) الوقت اللازم لتعقيم أحجام مختلفة من البيئة.

جدول 1: الزمن اللازم لتعقيم أحجام مختلفة من البيئة على درجة 121 °م (Pierik 1987).

ويلاحظ أن الحجم الأكبر من البيئة يتطلب زمن تعقيم أطول وذلك لطول الزمن اللازم لوصول درجة الحرارة في وسط الوعاء المحتوى على البيئة إلى درجة الحرارة المطلوبة. ويكون التلوث البكتيري والفطري واضحاً على سطح البيئة شبه الصلبة والأنسجة النباتية أو قد تظهر أعراض الإصابة بالكائنات الدقيقة في شكل بقع لونها بني على الأوراق أو السوق. أما في حاله المزارع السائلة فإن التلوث يظهر على شكل عكارة إذا كان التلوث بكتيري أما التلوث الفطري فيتضح في وجود كرات من الفطر. وقد تلوث البيئة والزجاجيات ببعض المواد الطيارة إذا كانت بعض الأدوات أو البيئة مغلفة بورق عادى كذلك فإن الأغطية البلاستيكية ينتج عنها غاز الإثيلين الذي يذوب في البيئة وقد يثبط النمو.

تتكسر بعض المواد العضوية كالأحماض الأمينية، الفيتامينات، منظمات النمو، اليوريا جزئيا أو كلياً عند تعقيمها خاصة عند وجودها مع بعض المكونات الأخرى في البيئة. وتزيد حساسية هذه المواد للحرارة بارتفاع درجة الحرارة وزيادة فترة التعقيم. ومن ثم يفضل تعقيم الأحجام الكبيرة من البيئة في عبوات صغيرة حتى لا نضطر لإطالة فترة التعقيم. وفي معظم الحالات يمكن تعقيم المواد الحساسة جزئيا للحرارة مع باقي مكونات البيئة بشرط ألا تزيد مدة التعقيم عن 15 - 20 دقيقه، أما المواد شديدة الحساسية للحرارة فإنها تعقم بالترشيح وتضاف للبيئة بعد التعقيم وقبل صبها في أوعيه الزراعة مباشرة. ويوضح جدول رقم (2) بعض مكونات البيئة ومدى حساسيتها للحرارة كما أوضحها (1993) George. فعلى سبيل المثال السكر وبعض السكريات الثنائية والثلاثية تتحلل مائيا عند تعقيمها في وسط حامضي فيتحلل السكر إلى فركتوز وجلوكوز وعموما ليس هناك تأثير ضار لهذا التحلل.

وقد تحدث عملية كرمله للسكريات وتتكون بعض الأحماض من السكريات الأحادية بفعل التعقيم، وبذلك ينخفض الرقم الهيدروجيني ولا يتصلب الآجار. وقد أنخفض الرقم الهيدروجيني عند تعقيم بيئة MS المضاف إليها 30 جم/لتر من الفركتورز أو المالتوز عند التعقيم لمدة 20 دقيقة ودرجة حرارة 121 م. وبخفض زمن التعقيم إلى 13 دقيقة وفتح جهاز التعقيم فور انخفاض الضغط إلى الضغط الجوي تصلب الأجار ولم يلاحظ تلوث في المزرعة. وتزيد عمليات التحلل المائي والكرمله، وتكوين الأحماض. عند تعقيم السكر مع باقي مكونات البيئة عن تعقيم السكر في محلول مائي دون باقي مكونات البيئة وعموما ليس هناك ضرر كبير ينتج عند تعقيم السكر مع البيئة إلا إذا كانت مدة التعقيم طويلة حيث تنتج بعض المواد المثبطة للنمو عند تعقيم الجلوكوز مع الفوسفات والأحماض الأمينية. والجلوكوز الذي يضاف إلى بعض البيئات أو الناتج من تحلل السكر يمكن أن يتكسر بالحرارة في وجود الفوسفات والوسط الحامضي وينتج عنه أنواع أخرى من السكريات. وقد وجدت بعض الاستجابات المختلفة في زراعة الأنسجة عند مقارنة تعقيم السكر مع البيئة أو إضافته بعد تعقيمه بالترشيح. ويتضح من جدول رقم (2) أن بعض منظمات النمو تتكسر أثناء التعقيم. ويمكن من الناحية العملية في الإكثار الدقيق إهمال التغير الحادث لمعظم الأوكسينات والسيتوكينينات أثناء التعقيم على الرغم من ملاحظة تكسير جزء من IAA و IBA لكن يفضل تعقيم IAA و Kinetin و GA بالترشيح.

جدول 2: تأثير حرارة التعقيم على بعض مكونات البيئة (1993 ,George).